利用油茶粕基質(zhì)培養(yǎng)食用菌的初步研究

余 姣 ，鐘海雁 ，周 波 ，譚著明 ，申愛榮 ，馮 納

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004）

利用油茶粕基質(zhì)培養(yǎng)食用菌的初步研究

余 姣1，鐘海雁1，周 波1，譚著明2，申愛榮2，馮 納1

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004）

為了篩選能高效利用油茶粕進(jìn)行培養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)食用菌，就含有不同濃度油茶粕的培養(yǎng)基對11種食用菌菌絲生長的影響情況及菌絲對茶皂素的降解情況進(jìn)行了試驗(yàn)研究。結(jié)果表明：在培養(yǎng)基中分別添加25%、50%、70%的油茶粕后，除雞腿菇外，各菌種均能正常生長，其中羊肚菌、猴頭菇、西峽椴木香菇、小白菇的生長狀態(tài)最好；除雞腿菇外，各菌種均能降低油茶粕培養(yǎng)基中茶皂素的含量，其中羊肚菌、西峽椴木香菇及小白菇這3種菌的降解效果最明顯，最高降解率分別達(dá)到62.38%、70.52%、65.57%；根據(jù)菌絲的生長速度及其對茶皂素的降解情況，篩選出的優(yōu)勢食用菌種分別為羊肚菌、西峽椴木香菇、小白菇。

油茶粕；培養(yǎng)基；食用菌；菌絲體；茶皂素

我國現(xiàn)有油茶栽培面積近400萬hm2，年產(chǎn)油茶籽約180萬t，提取茶油后的副產(chǎn)物油茶餅粕約130萬t[1-3]。目前我國油茶綜合加工利用技術(shù)匱乏，特別是油茶粕深加工和綜合利用技術(shù)不足，茶油加工后副產(chǎn)物的綜合利用還停留在較低的技術(shù)層面上，尚未考慮到油茶副產(chǎn)物開發(fā)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場前景，導(dǎo)致副產(chǎn)物沒有得到充分的利用，嚴(yán)重影響了企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的提高。尤其是油茶粕中的單一成分影響了產(chǎn)品的功能性和使用價(jià)值，如茶皂素的存在影響了油茶粕作為飼料使用的難度等。油茶粕含粗蛋白15%、糖類40%、粗纖維6%[4]，可以作為食用菌生長所需的氮源和碳源，所以油茶粕可以作為食用菌生長的良好底物加以利用。

我國是食用菌生產(chǎn)大國，我國食用菌總產(chǎn)量占世界食用菌總產(chǎn)量的70%以上[5]。食用菌能分泌一些胞外酶，如木質(zhì)素降解酶，包括漆酶（Laccase）、錳過氧化物酶（Mn-peroxidase）、木質(zhì)素過氧化酶（Lignin peroxidase），纖維素酶，果膠酶，木聚糖酶，氧化酶等。與食用菌基質(zhì)降解密切相關(guān)的酶主要有纖維素酶、漆酶、多酚氧化酶、淀粉酶、蛋白酶等[6]。早在 1985 年，Leatham[7]就曾報(bào)道了香菇在木質(zhì)纖維素培養(yǎng)基降解過程中產(chǎn)生的不同胞外酶；Willick 和 Seligy[8]則描述了裂褶菌（Schizphylhls commne）纖維素酶的多樣性。食用菌在菌絲生長過程中能夠降解油茶粕中的茶皂素，有望解決茶皂素影響動物適口性的難題，為油茶粕作為飼料利用提供了可行性。

近年來有關(guān)以食用菌綜合處理油茶粕的研究報(bào)道甚少。為此，本文以油茶粕為主要培養(yǎng)基質(zhì)，對羊肚菌、猴頭菇、西峽椴木香菇、野生平菇、小白菇、杏鮑菇、白靈菇、L26香菇、灰樹花、神農(nóng)靈芝和雞腿菇等11種食用菌進(jìn)行了菌絲培養(yǎng)試驗(yàn)，以期篩選出能以油茶粕為主要培養(yǎng)基質(zhì)的食用菌菌種，從而實(shí)現(xiàn)油茶粕有機(jī)廢棄物資源的高效利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種及原料

供試菌種分別為羊肚菌Morchella esculenta、猴頭菇Hericium erinaceus、西峽椴木香菇Xixia basswoodlentinus edodes、野生平菇Pleurotus ostreatus、小白菇Russula albidaPeck、杏鮑菇Pleurotus eryngii、 白 靈 菇Pleurotus nebrodensis、L26香菇L26lentinus edodes、灰樹花Grifola frondosa、神農(nóng)靈芝Ganoderma lucidum和雞腿菇Copyinds comatus，供試菌種均由湖南省林業(yè)科學(xué)研究院林下經(jīng)濟(jì)研究所提供。

供試油茶粕及麩皮均為市售品；生石灰及石膏粉均購自江門食品添加劑有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

主要試劑香草醛、濃硫酸、無水乙醇、正丁醇、蔗糖、KH2PO4皆為分析純。

主要儀器：電熱鼓風(fēng)干燥箱，上?！憧茖W(xué)儀器有限公司；QE-300萬能粉碎機(jī)，浙江屹立工貿(mào)有限公司；超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；RGX型人工氣候培養(yǎng)箱、電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000A ，上海比朗儀器有限公司；721可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試培養(yǎng)基配方

菌種培養(yǎng)基配方見表1。每個(gè)配方均按比例稱取各組分，加入65%～70%的水后攪拌均勻，裝入容積為240 mL的組培瓶中，每瓶培養(yǎng)料凈重90～100 g，將瓶口擦凈后蓋上瓶蓋，置于電熱高壓立式滅菌鍋中滅菌，溫度為121 ℃，間歇滅菌2次，每次1 h。

表1 培養(yǎng)基配方Table 1 Formulas of culture media %

1.2.2 PDA培養(yǎng)基的制作方法

將市售馬鈴薯洗凈、去皮、切片，準(zhǔn)確稱取200 g置于不銹鋼鍋中，加入1 L水，加熱煮沸10 min，過濾，調(diào)整濾液體積至1 L，加入20 g葡萄糖和18 g瓊脂，用玻璃棒攪拌至完全溶解，加熱煮沸10 min，調(diào)整體積至1 L。分裝倒入已洗凈的錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶約倒入200～300 mL即可，瓶口用聚丙烯塑料帶孔的紙封好，于121 ℃條件下滅菌30 min。滅菌結(jié)束后，倒入事先已作滅菌處理的培養(yǎng)皿中，其厚度在0.2cm左右，冷凝后待用。

1.2.3 母種的活化

將保藏在冰箱中的各菌種的母種取出， 無菌條件下接種在PDA平板培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株接種3個(gè)培養(yǎng)皿，于22 ℃下培養(yǎng)5～7 d。

1.2.4 原種的擴(kuò)大培養(yǎng)

母種培養(yǎng)5～7 d后選取生長狀況較好的活化菌株，在無菌條件下接種到PDA平板正中央，以保證菌絲生長均勻。每個(gè)菌株接種3個(gè)培養(yǎng)皿，22 ℃下培養(yǎng) 10 d。

1.2.5 打孔接種與發(fā)菌

將11種供試菌種擴(kuò)大培養(yǎng)后在無菌條件下打孔接種，分別接入表1中4種不同配方的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每種菌在每個(gè)配方上設(shè)置10個(gè)重復(fù)。在超凈工作臺無菌條件下接入菌種，將接種好的培養(yǎng)瓶立即移入人工氣候培養(yǎng)箱中，在溫度為25 ℃、濕度為75%的條件下進(jìn)行遮光培養(yǎng)。

1.2.6 測定各菌種的菌絲長度

培養(yǎng)第6天開始記錄菌絲生長情況，定時(shí)測量菌絲在培養(yǎng)瓶內(nèi)向下生長的長度，以瓶內(nèi)菌線生長的下緣到瓶頂?shù)木嚯x來計(jì)算菌絲的長度。

1.2.7 茶皂素的提取與測定方法

1.2.7.1 茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取市售茶皂素（浙江東方茶業(yè)科技股份有限公司，純度≥95%）標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g，置于100 mL容量瓶中，加入80%乙醇適量，使之全部溶解，定容到刻度，搖勻，即得1mg/mL的茶皂素標(biāo)準(zhǔn)母液。從1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液中分別取5、10、15、20、25 mL的溶液，用80%的無水乙醇定容到25 mL，分別得到0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.7.2 取 樣

待菌絲長滿瓶（以菌絲穿透瓶內(nèi)基質(zhì)底部為標(biāo)準(zhǔn)）[9]后取樣測其茶皂素含量。每種菌隨機(jī)取其滿瓶培養(yǎng)瓶3瓶，掏出其培養(yǎng)料，并置之于烘箱中，于60 ℃下烘干至恒重，粉碎，過100目篩，保存以備用。

1.2.7.3 茶皂素的提取方法

采用劉紅梅[10]采用的方法（有所改變）提取茶皂素：取粉碎后過100目篩的油茶粕培養(yǎng)料粉5 g裝入燒瓶中，再加入80%的乙醇溶液150 mL，于98 ℃下索氏抽提3 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上加熱真空濃縮至粘稠狀，加入20 mL水溶解，再加入水飽和的正丁醇溶液，于分液漏斗中等體積萃取3次，合并正丁醇萃取液，濃縮至干，用80%的乙醇溶液溶解，并定容至250 mL，搖勻以備用。

1.2.7.4 茶皂素的測定方法

采用劉紅梅采用的方法[10]測定茶皂素：精密量取樣品溶液0.5 mL置于外有冰水浴的10 mL的具塞試管中，精密加入8%的香草醛溶液0.5 mL和77%的硫酸5 mL，充分搖勻。將混合物于60 ℃水浴加熱顯色20 min后置于冰水浴中冷卻10 min，取出具塞試管，等混合物的溫度升至室溫時(shí)，以試劑空白為參比，用1cm的比色皿在最大吸收波長545 nm處測定其吸光度。茶皂素的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 11種食用菌在含有不同濃度油茶粕的培養(yǎng)基上其菌絲生長情況的比較

圖2A～K顯示了11種食用菌分別在含有0%、25%、50%和70%不同濃度油茶粕的培養(yǎng)基上其菌絲的生長趨勢。

2.1.1 不同菌種在含有同一濃度油茶粕的培養(yǎng)基上的生長情況

從圖2中可以看出，不同菌種在含有同一濃度油茶粕的培養(yǎng)基上其菌絲的生長情況表現(xiàn)出一定的差異性。

圖 2 11種食用菌在含有不同濃度油茶粕的培養(yǎng)基上其菌絲的生長趨勢Fig. 2 Mycelium growth trends of eleven kinds of edible mushrooms in the media with different concentrations of Camellia meal

在含有0%油茶粕的培養(yǎng)基上，羊肚菌、西峽椴木香菇、野生平菇、小白菇菌絲的生長速度要顯著快于其他菌種。接種后的第6天，羊肚菌的菌絲就長至1.53cm，西峽椴木香菇長至0.81cm，野生平菇長至0.39cm，小白菇長至0.07cm；培養(yǎng)至第14天時(shí)，羊肚菌和西峽椴木香菇的菌絲長度均已超過組培瓶的2/3，野生平菇和小白菇的菌絲長度甚至超過組培瓶的1/2；培養(yǎng)至第22天時(shí)，以上4種菌的菌絲基本長滿組培瓶，其菌絲長度與神農(nóng)靈芝的菌絲長度（4.90cm）之間的差異顯著（p＜0.05），而與其余菌種間的差異極顯著（p＜0.01）。

在含有25%油茶粕的培養(yǎng)基上，相比于其他7種菌而言，羊肚菌、西峽椴木香菇、野生平菇、小白菇菌絲的生長情況要好些。培養(yǎng)至第22天時(shí)，羊肚菌的菌絲長度為6.18cm，已長滿整個(gè)組培瓶；西峽椴木香菇的菌絲長至4.49cm，達(dá)到組培瓶的2/3以上；野生平菇和小白菇均長至組培瓶的1/2以上。猴頭菇的菌絲長度為2.44cm，其與羊肚菌、西峽椴木香菇和野生平菇間的差異均極顯著（p＜0.01），與小白菇間的差異顯著（p＜0.05），而杏鮑菇、白靈菇、L26香菇、灰樹花和神農(nóng)靈芝的菌絲長度都在1.90cm以下，其與長得較快的上述四種菌的菌絲長度間均有極顯著差異（p＜0.01）。雞腿菇在整個(gè)培養(yǎng)過程中其菌絲都未生長，可能因?yàn)橛筒杵膳囵B(yǎng)基質(zhì)中的茶皂素對其生長有較強(qiáng)的抑制作用[11]，說明雞腿菇對茶皂素的耐受性極差。

在含有50%油茶粕的培養(yǎng)基上，羊肚菌、猴頭菇、西峽椴木香菇和小白菇的生長勢頭均比其他7種菌好，特別是羊肚菌和猴頭菇對油茶粕培養(yǎng)基的適應(yīng)能力非常強(qiáng)。在培養(yǎng)至第22天時(shí)，羊肚菌的菌絲長度為6.04cm，猴頭菇的菌絲長度為5.38cm，其菌絲都將近長滿整個(gè)組培瓶；西峽椴木香菇的菌絲長度為4.02cm，約為組培瓶的2/3；小白菇的菌絲長度為3.12cm，達(dá)到組培瓶的1/2以上。野生平菇的菌絲長度為2.17cm，與羊肚菌、猴頭菇和西峽椴木香菇的菌絲長度差異均極顯著（p＜0.01），與小白菇的菌絲長度差異顯著（p＜0.05）；而杏鮑菇、白靈菇、L26香菇、灰樹花和神農(nóng)靈芝的菌絲長度都在1.70cm以下，其與長得較快的4種菌的菌絲長度也都有極顯著的差異（p＜0.01）。與在含有25%油茶粕的培養(yǎng)基上的菌絲生長情況一樣，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，雞腿菇一直都未生長。

在含有70%油茶粕的培養(yǎng)基上，供試菌種的菌絲生長情況與其在50%油茶粕培養(yǎng)基上的相似，仍然是羊肚菌、猴頭菇、西峽椴木香菇、小白菇的生長速度快于其他7種菌。不過，羊肚菌和猴頭菇大約要到培養(yǎng)第30天才長滿組培瓶。這可能因?yàn)椋S著油茶粕培養(yǎng)基中茶皂素含量的增加，菌絲生長受到的抑制作用也會隨之加強(qiáng)。培養(yǎng)至第30天時(shí)，西峽椴木香菇的菌絲長度為3.80cm，小白菇的菌絲長度為3.56cm，兩者的菌絲長度均達(dá)到組培瓶的2/3以上。野生平菇的菌絲長度為3.28cm，與羊肚菌和猴頭菇的差異均顯著（p＜0.05），其與西峽椴木香菇和小白菇間均無顯著差異（p＞0.05），而杏鮑菇、白靈菇、L26香菇、灰樹花和神農(nóng)靈芝的菌絲長度都在2.60cm以下，其與長得較快的4種菌的菌絲長度間均有極顯著差異（p＜0.01）。雞腿菇在含有70%油茶粕的培養(yǎng)基上仍然不長。

2.1.2 同一菌種在含有不同濃度油茶粕的培養(yǎng)基上的生長情況

從圖2A中可以看出，猴頭菇在含有不同濃度油茶粕的培養(yǎng)基上的生長速度為50%＞70%＞0%＞25%，這可能因?yàn)椋?dāng)油茶粕中的茶皂素超過一定量時(shí)，茶皂素對猴頭菇的生長抑制效果反而不明顯了[12]。圖2B～K顯示，各菌種在不同濃度的油茶粕培養(yǎng)基上生長的整體趨勢一樣，即0%＞25%＞50%＞70%，這說明隨著培養(yǎng)基中油茶粕濃度的增加，羊肚菌、西峽椴木香菇、小白菇、野生平菇、杏鮑菇、白靈菇、L26香菇、神農(nóng)靈芝及灰樹花等9種菌的菌絲對茶皂素的耐受性越來越差，菌絲生長得越來越緩慢。這一結(jié)果從另一方面證明了茶皂素的抑菌特性[13]。

總的來說，在含有25%、50%和70%這3個(gè)濃度油茶粕的培養(yǎng)基上，羊肚菌、西峽椴木香菇和小白菇的生長勢頭都顯著優(yōu)于其他8種菌（p＜0.01），說明這3種菌都是適合在油茶粕培養(yǎng)基中生長的菌種。

2.3 不同食用菌對不同濃度油茶粕培養(yǎng)基質(zhì)中茶皂素的降解情況

供試的11種食用菌對不同濃度油茶粕培養(yǎng)基質(zhì)中茶皂素的降解率見表2。由表2可知，除不在油茶粕培養(yǎng)基上生長的雞腿菇外，其余10種菌都能降解油茶粕中的茶皂素，菌株不同，其對茶皂素的降解規(guī)律也不同[14]。在含有25%油茶粕的培養(yǎng)基上，西峽椴木香菇、野生平菇、小白菇和羊肚菌對培養(yǎng)基中茶皂素的降解率都達(dá)到60%以上，與猴頭菇對茶皂素的降解率（32.27%）相比，這4種菌對茶皂素的降解率均約提高30%，且與其他菌種的降解率之間都有極顯著差異（p＜0.01）。在含有50%油茶粕的培養(yǎng)基上，小白菇、羊肚菌和西峽椴木香菇對茶皂素的降解效果都較好，降解率均在50%以上，相比于降解效果最差的灰樹花，其降解率均提高了20%以上。在含有70%油茶粕的培養(yǎng)基上，小白菇、西峽椴木香菇、羊肚菌和白靈菇對茶皂素的的降解能力均明顯強(qiáng)于其余菌種，其降解率均在44%以上。綜合考察各菌種對含有25%、50%、70%的油茶粕培養(yǎng)基中茶皂素的降解情況可知，小白菇、西峽椴木香菇和羊肚菌在此3個(gè)濃度的油茶粕培養(yǎng)基上都能很好地降解油茶粕中的茶皂素，其降解效果和其他菌種間均有顯著性差異（p＜0.01）；而其他菌種對茶皂素的降解能力均較弱，這可能因?yàn)?，在培養(yǎng)過程中，這些菌種所處的外環(huán)境與它們的最適生長環(huán)境不一致，產(chǎn)生生物活性酶（如纖維素分解酶、蛋白分解酶）的活性條件降低了，因而影響各種酶活性的發(fā)揮，從而導(dǎo)致其對茶皂素的降解能力下降[15]，也有可能因?yàn)榫N本身對茶皂素的降解能力就較弱。

表2 11種食用菌對不同濃度油茶粕培養(yǎng)基質(zhì)中茶皂素的降解率Table 2 Degradation rates of eleven kinds of edible mushrooms on tea saponin in the media with different concentrations of Camellia meal

3 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同食用菌菌種在油茶粕培養(yǎng)基上的生長特性及其對油茶粕培養(yǎng)基中茶皂素的耐受力是不同的。因?yàn)槭秤镁饕ㄟ^分泌一些胞外酶而將培養(yǎng)基質(zhì)里的大分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)并加以利用，由此推斷，不同菌種所產(chǎn)生的胞外酶的種類是不同的[16]。在供試的11種菌種中，羊肚菌、西峽椴木香菇和小白菇在油茶粕培養(yǎng)基上均能較好地生長，且其對油茶粕中的茶皂素都有較強(qiáng)的降解能力。猴頭菇雖然能在50%和70%油茶粕培養(yǎng)基上有旺盛的生長勢頭，但其對油茶粕中茶皂素的降解率卻都在40%以下。綜合考慮，最適于油茶粕培養(yǎng)基上生長的菌種是羊肚菌、西峽椴木香菇和小白菇這3種菌。但是，關(guān)于最能促使以上3種優(yōu)勢菌生長的培養(yǎng)基中油茶粕的最佳配比，還需作進(jìn)一步的研究，至于食用菌降解茶皂素的作用機(jī)制及其降解中間產(chǎn)物、最終產(chǎn)物具體含有什么成分也有待于深入研究。

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Preliminary study on culturing edible mushroom through applyingCamelliameal medium

YU Jiao1, ZHONG Hai-yan1, ZHOU Bo1, TAN Zhu-ming2, SHEN Ai-rong2, FENG Na1
(1. Central South University of Forestry &Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2. Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, Hunan, China)

The stituation of growing and degrading tea saponin of 11 kinds of edible mushroom mycelium in the media with different concentrations ofCamelliameal was investigated, as to fi nd out the edible mushrooms which can ef fi ciently utilizeCamelliameal. The results showed that each strain could normally grow in media with 25%, 50% and 70% ofCamelliameal, exceptCopyinds comatus. The mycelia growth ofMorchella esculenta,Hericium erinaceus,Xixia basswoodlentinus edodes andRussula albidaPeck well grew in the three culture media. The strains could degrade tea saponin inCamelliameal media expectC. comatus, the degradation effects ofM. esculenta,X. basswoodlentinus edodes andR. albidaPeck were better, and the degradation rates were 62.38%, 70.52% and 65.57%, respectively.M. esculenta,X. basswoodlentinus edodes andR. albidaPeck should be suited toCamelliameal medium based on mycelium growth speed and degrading tea saponin stituation.

Camelliameal; culture medium; edible mushroom; mycelium; tea saponin

S609.9；S789.9

A

1003—8981(2015)04—0090—06

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.04.016

2015-06-10

國家油茶工程技術(shù)研究中心開放基金項(xiàng)目（2014C201-2），國家林業(yè)局林業(yè)科學(xué)技術(shù)推廣項(xiàng)目（〔2014〕57號）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2015B289），中南林業(yè)科技大學(xué)研究生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（CX2015B08）。

余 姣，碩士研究生。

鐘海雁，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師。E-mail：zhonghaiyan631210@126.com

余 姣, 鐘海雁,周 波,等.利用油茶粕基質(zhì)培養(yǎng)食用菌的初步研究[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2015,33(4)：90－95, 118.

[本文編校：伍敏濤]