液－質聯用分析金線蓮中4種黃酮類化合物

黃麗萍，黃麗英，林守二，俞曉玲

金線蓮（Anoectochilusroxburghii，A.roxburghii）系蘭科開唇蘭屬草本植物，主要分布于亞洲的中國、日本、斯里蘭卡和印度等國，在中國以福建、浙江為主產地，素有“神藥”、“金草”、“藥王”等美稱，具有清熱涼血解毒、固腎平肝、降血糖、降血壓和消炎等功效，民間多用于治療糖尿病、高血壓、乙型肝炎等疾病[1－7]。據報道，金線蓮中含有甾體化合物、糖苷類化合物、有機酸、黃酮類及黃酮苷類化合物、生物堿和核苷類物質等[8－14]。

黃酮類化合物廣泛分布于植物界中，是許多中藥的有效成分，具有抗菌消炎、擴張冠狀動脈、防治高血壓及腦出血等多方面的生物活性[15]。異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素是中藥中常見的黃酮類化合物[15]，其中異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷具有強烈的刺激動脈內皮細胞產生前列環(huán)素和組織多肽抗原（tissue polypeptide antigen，tPA）的活性，同時對家兔體內、外血小板聚集功能有明顯的抑制作用[16]；異槲皮苷具有一定的抗氧化、抗腫瘤和抗血小板凝集作用及抗抑郁作用[17－18]；槲皮素具有抗氧化及清除自由基的作用，還具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降壓、免疫調節(jié)及心血管保護作用等[19]；異鼠李素具有止咳祛痰、消食化滯和活血散瘀等作用[20]。

筆者應用反相高效液相色譜（reverse phasehigh performance liquid chromatography，RP－HPLC）法梯度洗脫測定金線蓮中上述的4種具有重要藥理活性的黃酮類物質，電噴霧電離／離子阱質 譜 法 （electro－spray ionization／ion trap mass spectrometry，ESI／MS）對提取物中這4種黃酮類化合物進行鑒別，首次發(fā)現金線蓮中含有異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷，為金線蓮的藥理作用提供物質基礎和佐證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 金線蓮干燥全草（福州同春藥業(yè)有限公司），產地廣西和福建，經福建醫(yī)科大學藥學院天然藥物化學系張永紅教授鑒定。

1.1.2 試劑 異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷（批號：111571－200402，中國藥品生物制品檢定所）；異槲皮苷（批號：43089，阿拉丁試劑公司）；槲皮素（批號：1216002，阿拉丁試劑公司）；異鼠李素（批號：35961，阿拉丁試劑公司）；甲醇（色譜純）、乙酸（分析純）、氨水（分析純）（國藥集團化學試劑有限公司）；實驗用水皆為實驗室自制二次蒸餾水。

1.1.3 儀器 傾倒式粉碎機（DJ－10A，上海淀久中藥機械制造有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀（RE－52AA）、自動三重純水蒸餾器（SZ－97）（上海亞榮生化儀器廠）；紫外可見分光光度計（752PC，上海光譜儀器有限公司）；電子天平（BS 110S，北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；醫(yī)用數控超聲清洗器（KQ－250DE，昆山市超聲儀器有限公司）；HPLC－MSD高效液相色譜－質譜聯用儀（1200型）、Agilent TC－C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）（美國 Agilent公司）；高效液相色譜儀（LC－20A，日本島津公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB－III，鄭州長城科工貿有限公司）；低速多管離心機（80－2型，常州國華電器有限公司）。

1.2.1 色譜條件色譜柱：Agilent TC－C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：A 為0.8%乙酸＋0.2%氨水溶液，B為甲醇；流速：1.0mL／min；梯度洗脫：0～10min，50%～58%B，10～30min，65%B；檢測波長368nm，柱溫30℃，進樣量20μL。

1.2.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI源），正離子監(jiān)測，ESI（＋）；噴霧氣和干燥氣都是氮氣，簾氣（噴霧氣）：30psi；碰撞氣（CAD）流速15mL／min；源噴射電壓（IS）：4000V；源溫度（TEM）：350℃；加熱氣（GS2）：60psi。掃描范圍：異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷的質荷比（m／z）為50～700；其他3種物質為50～500。

1.2.3 對照品溶液的配制 分別精確稱取異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素對照品0.010 0，0.010 0，0.010 5，0.010 0g，用少量甲醇超聲溶解后定容至10mL容量瓶中，異鼠李素定容至50mL容量瓶中，制得濃度分別為1.00，1.00，1.05，0.20mg／mL對照品儲備液，于4 ℃冰箱保存，備用。臨用時稀釋成系列標準溶液。

1.2.4 供試品溶液的配制 精確稱取金線蓮樣品1g，置小燒杯中，用20mL甲醇超聲萃取30min，提取溫度為45℃，3 000r／min離心10min，取上清液。濾渣重復提取2次，合并上清液，置于50℃旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，濃縮萃取液少量多次用甲醇溶解，并定容于5mL容量瓶中，即得供試品溶液，待測。

1.2.5 精密度試驗 取混合對照品溶液（其中異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素濃度分別為50，40，42，50μg／mL）在上述色譜條件下，重復進樣3次，測其峰面積。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗 吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24h進樣，測待測組分的峰面積。

1.2.7 重現性試驗 按供試品溶液制備方法制備5份供試品溶液，分別進樣20μL，按上述色譜條件測定峰面積。

3.3 記憶力 記憶力主要指識記、保持、再認識、重現客觀事物所反映出來的內容及經驗的能力，其是認知功能研究的重要方面，良好的睡眠可有效促進新記憶的保存及鞏固，而失眠患者往往受到睡眠缺失的影響，無法進行正常的記憶鞏固，導致失眠患者的記憶能力受損，通常表現為記憶鞏固功能受損、學習能力下降、長時記憶受損等。失眠患者對記憶的保存及整合能力受損的主要因素是慢波睡眠減少，而快速動眼期在失眠患者的記憶鞏固中發(fā)揮重要作用。許良和王博[21]對1 954例失眠患者進行調查，結果發(fā)現伴有記憶力減退的患者約占80.71%。

1.2.8 加樣回收率試驗 精確稱取12份已知含量的金線蓮樣品，平分為4組，按高、中、低水平分別精密加入4種黃酮物質的標準品溶液，按樣品溶液制備的方法操作及前述色譜條件測定峰面積。

2 結 果

2.1 標準溶液和金線蓮提取物的HPLC－UV分析

在上述選擇的色譜條件下，采用UV法得到4種黃酮類混合標準品、金線蓮超聲萃取物的HPLC分離的色譜圖。圖1為標準品的色譜圖，其中異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素的保留時間分別為6.534，7.913，14.498，18.622min。根據色譜的保留時間和加入標準品于樣品中，樣品中對應標準品相應保留時間處峰高增高，圖2中1～4號峰初步鑒定為異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素。

圖1 混合對照品的色譜圖Fig 1 Chromatograms of mixing standard solution

圖2 樣品的色譜圖Fig 2 Chromatograms of the sample

2.2 LC－MS分析 在上述1.2.2質譜條件下，對異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素對照品和保留時間分別6.534，7.913，14.498和18.622min樣品的色譜峰進行質譜分析，對照品質譜圖見圖3。金線蓮超聲提取物色譜圖對應1～4號色譜峰的ESI／MS質譜圖見圖4，4種黃酮主要二級質譜碎片歸屬見表1。

圖3 異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素對照品的電噴霧離子源質譜圖Fig 3 ESI／MS of isorhamnetin－3－O－neohesperidoside and isoquercitrin and quercetin and isorhamnetin standard substance

圖4 樣品中異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素的電噴霧離子源質譜圖Fig 4 ESI／MS of isorhamnetin－3－O－neohesperidoside and isoquercitrin and quercetin and isorhamnetin in sample

基于質譜的m／z值推斷，異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素的可能裂解途徑見圖5。

2.3 標準曲線的制備及線性關系的考察 分別精密移取上述儲備液各1.0mL（異鼠李素5.0mL）于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，混勻配成混合標準品溶液，各濃度依次為100，100，105，100μg／mL。按等比對半稀釋原則分別置于10mL的容量瓶中，甲醇定容，得到一系列混合對照品溶液（濃度見表2），在上述色譜條件下進樣20μL，測定3次，得峰面積平均值。以峰面積為縱坐標y，對照品濃度為橫坐標x（μg／mL），進行線性回歸，分別繪制標準曲線，并計算回歸方程，結果見表3。

圖5 異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素裂解途徑Fig 5 A tentative pathway for the mass spectral fragmentation of sorhamnetin－3－O－neohesperidoside and isoquercitrin and quercetin and isorhamnetin

表1 4種黃酮主要二級質譜碎片歸屬Tab 1 The second class mass spectrum relegation of the four kinds of flavonoids

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 測得異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素峰面積的相對標準偏差 （RSD）分 別 為 3.51%，2.92%，2.69% 和2.06%。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 測得異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素峰面積的RSD分別為2.64%，2.12%，2.83%和2.89%，表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定性良好。

表2 系列混合對照品溶液濃度Tab 2 Series of mixed reference solution concentration table μg／mL

表3 4種組分的回歸方程、相關系數和線性范圍Tab 3 Regression equation，correlation coefficient and linear range of the four constituents

2.4.3 重現性試驗 測得異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素峰面積的RSD分別為1.58%，2.67%，2.35%，2.94%。

2.4.4 加樣回收率試驗 測得異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素的平均回收率分別為94.26%，95.86%，96.31%，95.46%；RSD分別為0.87%，0.80%，0.95%，1.27%。

2.5 樣品測定 取福建和廣西2個產地金線蓮細粉，按供試品溶液制備方法各制備5份供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定峰面積，以外標法計算含量，測得異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素含量分別為福建產地0.094，0.053，0.039 和 0.070mg／g，廣 西 產 地0.089，0.067，0.042和0.061mg／g。

3 討 論

3.1 檢測波長的選擇 異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素的標準品分別溶于甲醇中，用紫外可見分光光度計，在200～400nm的波長范圍內進行掃描，4種物質有2個吸收峰，峰位分別在254和368nm附近。檢測波長設定在254nm時，樣品峰多，干擾組分的測定，檢測波長為368nm時，各組分與干擾能很好分開，所以實驗時確定最佳檢測波長為368nm。

3.2 流動相及梯度洗脫條件的選擇 為了得到較好的色譜圖和適宜的出峰時間，曾比較不同體系或比例的流動相，實驗表明，乙腈－水體系分離效果較差，很難將所測的4種黃酮類物質分開；甲醇－水體系可以基本將所測的4種黃酮類物質分開，但是異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷分離度不高且槲皮素、異鼠李素峰形不好，難以使兩者達到較好的檢測水平，所以采用梯度洗脫并加入乙酸調節(jié)pH能得到較好的峰形和分離度，經比較0.6%乙酸和0.8%乙酸，發(fā)現0.8%乙酸并加入0.2%氨水最適宜，再進一步以甲醇和0.8%乙酸與0.2%氨水作流動相進行流動相配比試驗，最終選定的方案為0～10min，50%～58%B；10.01～30min，65%B，分離度較好，保留時間和峰形都較佳。異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷與異槲皮苷、異槲皮苷與槲皮素、槲皮素與異鼠李素的分離度分別為1.74，4.76，1.98，此時這4種黃酮類物質可以完全分離。

3.3 提取條件的選擇 本實驗通過甲醇和乙醇超聲提取，表明甲醇超聲提取率較乙醇高。而用甲醇回流和甲醇超聲其提取率相當，但考慮到超聲提取實驗較簡便，則選擇甲醇超聲提取法提取金線蓮中4種黃酮類化合物。

3.4 質譜定性 基于m／z值、色譜保留時間、對照品和文獻數據進行比較和分析[21－24]，圖2中1～4號峰分別鑒定為異鼠李素－3－O－新橙皮糖苷、異槲皮苷、槲皮素、異鼠李素。

綜上所述，不同產地金線蓮中這4種具有重要藥理活性黃酮類化合物含量的差異不大，為金線蓮的藥理作用和開發(fā)應用的研究提供實驗方法和理論基礎。

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