一種經(jīng)濟穩(wěn)定的小鼠腭裂模型的建立

柴繼俠 張艷萍 尹海燕 李徽徽 周艷梅 賀文欣 王元元 張志誠

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院組胚教研室，蚌埠 233030;2山東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，濟南 250000;3蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，蚌埠 233030)

先天性腭裂畸形是由遺傳和環(huán)境因素共同作用 導(dǎo)致的多基因遺傳病，但其具體發(fā)病機制至今仍未完全闡明。在先天性腭裂畸形的發(fā)病機制研究中，穩(wěn)定的腭裂動物模型對研究人類腭裂的發(fā)病原因、演變機制及預(yù)防具有重要意義［1］。由于小鼠腭的正常發(fā)育及腭裂形成與人類十分相似，且繁殖周期短，產(chǎn)仔多，因此國內(nèi)外多使用小鼠來制備腭裂畸形動物模型。

四氯二苯并二惡英 (tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)是一類持久性環(huán)境有機污染物，由于其高毒性、難降解、強脂溶性，容易在食物鏈中產(chǎn)生蓄積作用，對人類健康和環(huán)境安全構(gòu)成極大威脅，可來源于汽車尾氣、垃圾焚燒、農(nóng)藥及劑等，易通過食物鏈及環(huán)境污染物進入生物體內(nèi)蓄積，危及人體健康［2］。近年來有研究發(fā)現(xiàn) TCDD與腭裂畸形發(fā)生密切相關(guān)［3，4］。

昆明小鼠是我國生產(chǎn)量、使用量最大的遠交系小鼠。通過TCDD誘導(dǎo)產(chǎn)生昆明小鼠腭裂動物模型，尚未見報道。因此，本文采用不同劑量的 TCDD灌胃不同妊娠天數(shù)(gestational day，GD)的昆明小鼠，通過計數(shù)胎鼠腭裂發(fā)生率、觀測胎鼠腭解剖結(jié)構(gòu)及組織結(jié)構(gòu)，建立一種穩(wěn)定高效的昆明小鼠腭裂畸形動物模型。

材料和方法

1.材料

1.1 實驗動物

成年未經(jīng)產(chǎn)昆明小鼠，周齡8－10周，體重25－30克，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 試劑

TCDD購自美國SIGMA公司，用超市出售的優(yōu)質(zhì)花生油配制成4μg/ml的濃度，HE試劑盒購自碧云天試劑公司。

2.方法

2.1 小鼠飼養(yǎng)

60只昆明小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，顆粒喂食，自來水隨意飲水，明暗周期各12小時，室溫20－22℃。下午6點小鼠按雌雄3:1合籠，次日上午8時查陰栓，陰栓陽性者記錄為孕 0天 (gestational day，GD0)。將孕鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組40只，對照組20只。

2.2 致畸方法

實驗組分為5個小組。其中3個小組分別于GD11.5、GD12.5和 GD13.5，一次性灌服20μg/kg的TCDD溶液。另外2個小組分別于GD12.5一次性灌服10μg/kg和40μg/kg的 TCDD溶液。對照組一次性灌服等劑量花生油。

2.3 毒性、致畸性檢測

記錄GD16.5時各組孕鼠一般情況和胎鼠存活情況，解剖鏡下觀察胎鼠有無腭裂和其他畸形，統(tǒng)計腭裂發(fā)生率。

2.4 組織學(xué)觀察

實驗組及對照組分別于 GD13.5、GD14.5、GD15.5和GD16.5剖腹取胎，部分胚胎用4% 多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片、HE染色，觀察各組胎鼠腭裂組織學(xué)特征。同時取 GD14.5、GD16.5時孕鼠及胎鼠的肝、肺器官，常規(guī)石蠟切片HE染色，光鏡下觀察各臟器的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 12.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析，腭裂發(fā)生率的比較用 x2檢驗和確切概率法。Peason線性相關(guān)分析TCDD劑量和腭裂發(fā)生率的相關(guān)性，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.給藥方案的確定

GD11.5、GD12.5和 GD13.5一次性灌服20μg/kg的 TCDD溶液，腭裂發(fā)生率為(23/33)69.7%、(36/44)81.82% 和(12/34)35.29%。GD11.5和GD12.5兩組之間腭裂發(fā)生率呈上升趨勢，雖差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但GD11.5組腭裂之間的距離較小，腭裂沒有GD12.5組明顯。GD12.5和GD13.5兩組之間腭裂發(fā)生率呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(表1)。故選取GD12.5作為最佳用藥時間。

表1 妊娠不同天數(shù)給予20μg/kg TCDD灌胃后胎鼠腭裂發(fā)生率Table 1 The incidence of fetalm ice cleft palate after given 20μg/kg TCDD lavage at different gestational day

GD12.5給予0、10、20和40μg/kg的TCDD溶液灌胃后，胎鼠腭裂發(fā)生率為(2/51)3.92%、(20/43)46.51%、(36/44)81.82% 和(50/51)98.04%。和對照組相比，TCDD實驗組腭裂發(fā)生率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(表 2)。和 20μg/kg組相比，10μg/kg和40μg/kg組腭裂發(fā)生率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。Peason線性相關(guān)分析顯示，TCDD劑量與腭裂發(fā)生率之間呈正相關(guān)(r=0.895，P ＜0.01)(圖1)。

各組孕鼠一般情況良好，無明顯的中毒、流產(chǎn)現(xiàn)象。胎鼠未見眼部、尾部、四肢和皮膚等畸形。GD12.5給予40μg/kg的TCDD組有1只死胎，其余均為活胎。

故后續(xù)實驗采用最佳的造模條件GD12.5灌胃40μg/kg TCDD為實驗組，對照組則給予等劑量玉米油。

表2 GD12.5給予不同劑量TCDD灌胃后胎鼠腭裂發(fā)生率Table 2 The incidence of fetalm ice cleft palate after given different dose TCDD by lavage on GD12.5

圖1 TCDD劑量與腭裂發(fā)生率的相關(guān)性Fig.1 The correlation between TCDD dose andthe cleft palate incidence

2.解剖鏡下觀察實驗組腭裂畸形形成

GD13.5時，實驗組及對照組胎鼠的側(cè)腭突位于舌兩側(cè)。GD14.5時，對照組胎鼠側(cè)腭突增大并呈對向生長，側(cè)腭突頭端開始融合;實驗組側(cè)腭突增大，但未出現(xiàn)融合。GD15.5和GD16.5時，對照組兩側(cè)腭突完全融合，形成完整的腭，GD16.5時腭的骨化明顯;實驗組側(cè)腭突體積繼續(xù)增大，GD15.5時兩側(cè)腭突之間的距離相對縮小，但未出現(xiàn)接觸融合，GD16.5時，側(cè)腭突之間的距離增大，頭端部分出現(xiàn)骨化，并形成腭裂畸形(圖2)。

3.光鏡下觀察實驗組腭裂畸形形成

GD13.5時，實驗組及對照組胎鼠的側(cè)腭突位于舌兩側(cè)。GD14.5時，對照組胎鼠側(cè)腭突上抬至舌上方，呈對向生長;實驗組側(cè)腭突體積增大，但未上抬，仍位于舌兩側(cè)。GD15.5和GD16.5時，對照組兩側(cè)腭突完全融合，融合處上皮縫消失，出現(xiàn)一個富含細胞的團狀區(qū)域;實驗組兩側(cè)腭突上抬至舌的上方，呈對向生長，但兩者之間距離大，未出現(xiàn)接觸融合，形成腭裂畸形(圖3)。

圖2 實驗組及對照組于 GD13.5～16.5時腭發(fā)育的解剖鏡觀察(Bar=80μm)Fig.2 The palatal development of the fetalmiceduring GD13.5 to GD16.5 in two groups by anatomical lens(Bar=80μm)

圖3 實驗組及對照組于GD13.5～16.5時腭組織的HE染色 (Bar=400μm)Fig.3 The palate developmentof the fetalmice during GD13.5 to GD16.5 in two groups by HE staining(Bar=400μm)

4.實驗組孕鼠及胎鼠肝、肺的組織學(xué)結(jié)構(gòu)正常

GD14.5時，實驗組孕鼠肝組織結(jié)構(gòu)與對照組相比，肝細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)，但肝細胞索排列仍比較規(guī)則;GD16.5時，兩組肝細胞的組織結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯異常。孕鼠肺及胎鼠的肝、肺組織結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯異常(圖4)。

圖4 實驗組及對照組于GD14.5及GD16.5時，孕鼠、胎鼠的肝、肺組織HE染色(Bar=100μm)Fig.4 The organizational structure of liver and lung in pregnantmice and fetalmice on GD14.5 and GD16.5 in two groups by HE staining(Bar=100μm)

討 論

TCDD是二惡英中毒性最強的一種環(huán)境污染物，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、半衰期長，具有脂溶性，易通過食物鏈及環(huán)境污染物進入生物體內(nèi)蓄積，危及人體健康，尤其是干擾正常的胚胎發(fā)育［2］。近幾年越來越多的文獻采用 TCDD［5，6］或聯(lián)合使用糖皮質(zhì)激素類［7］誘導(dǎo)腭裂發(fā)生，此外還有維甲酸類［8］、甲基 N-硝基亞硝基胍 (MNNG)［1］等或聯(lián)合使用［9］。這些先天性腭裂畸形動物模型，主要用于腭裂病因?qū)W和發(fā)生機制方面的研究。

對不同致畸物質(zhì)或不同動物而言，腭裂畸形的發(fā)生條件不同，可能與致畸物質(zhì)不同的作用機制或種屬差異性、敏感性等有關(guān)。何曉夢等［3］研究顯示，GD10給予28μg/kg TCDD，是 C57BL/6J胎鼠腭裂模型建立的最適劑量，腭裂的發(fā)生率為93.02%。對ICR小鼠而言，GD10給予40 mg/kg MNNG，是該種腭裂畸形發(fā)生的最佳條件，但是腭裂的畸形率為55.2%［10］。全反式維A酸作用于昆明小鼠，理想腭裂動物模型的條件是GD10給予80 mg/kg劑量，腭裂的發(fā)生率為100%。絕大多數(shù)兩側(cè)腭突不能上抬至正常水平并向水平方向生長，極少部分發(fā)現(xiàn)有單側(cè)腭突上抬，腭突發(fā)育不全，體積較小，不能在中線相互接觸融合形成腭板［8］。本文研究顯示，對昆明小鼠而言，TCDD的最佳使用時間在 GD12.5，最佳使用劑量是40μg/kg，腭裂的發(fā)生率為98.04%。和其他模型相比，本文的模型成功率高，腭裂形成的具體過程和類型穩(wěn)定一致，對孕鼠和胎鼠其他臟器的毒性作用非常小。

腭器官發(fā)育是一個連續(xù)、復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括腭突的垂直生長、上抬、接觸及融合等關(guān)鍵步驟［3］。本研究對照組顯示，側(cè)腭突的發(fā)育也經(jīng)歷了垂直生長期(GD13.5)，上抬接觸期(GD14.5)和腭突融合期(GD15.5和 GD16.5)。和尹海燕等［8］等的結(jié)果相似。本研究實驗組結(jié)果顯示，和對照組相比，側(cè)腭突上抬延遲1天左右(GD14.5時仍位于舌兩側(cè);GD15.5時，側(cè)腭突上抬至舌的上方)，側(cè)腭突始終沒有接觸和融合(GD16.5時側(cè)腭突之間的距離更大)，形成腭裂畸形。因此本研究表明，TCDD主要通過延遲側(cè)腭突上抬誘導(dǎo)昆明小鼠腭裂畸形發(fā)生，與何曉夢等使用近交系小鼠的文獻［3］報道相似。然而有文獻報道TCDD主要通過干擾腭中嵴上皮分化、影響兩側(cè)腭突融合以誘導(dǎo)小鼠腭裂畸形發(fā)生［11，12］，出現(xiàn)這種不一致可能是由于所使用實驗動物的遺傳基因背景不同導(dǎo)致。腭裂的發(fā)生機制復(fù)雜多樣，不同致畸物質(zhì)、不同動物模型具體發(fā)生機制的研究將為腭裂機制的研究提供更廣的空間和思路。

本研究顯示，實驗組孕鼠肝臟在 GD14.5時肝細胞出現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)，可能是由于肝細胞對 TCDD進行解毒處理，發(fā)生脂肪樣變的緣故。在 GD 16.5時，肝細胞組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，說明孕鼠的肝細胞對該劑量的 TCDD可以代謝，不會造成肝細胞或肝組織結(jié)構(gòu)的明顯破壞。孕鼠一般情況良好，孕鼠肺、胎鼠肺以及胎鼠肝組織結(jié)構(gòu)無明顯異常，提示該劑量的TCDD沒有明顯的母體中毒癥狀。此外該劑量的 TCDD對胎鼠的發(fā)育毒性有明顯組織性特異性，跟以往報道一致［11，13］。

昆明小鼠是我國生產(chǎn)量、使用量最大的遠交系小鼠，抗病力強、繁殖快且價格低廉。本研究給予GD12.5昆明孕鼠一次性灌胃40μg/kg TCDD，成功地建立穩(wěn)定、高效的昆明小鼠腭裂畸形動物模型，腭裂發(fā)生率高達98.04%，TCDD主要通過延遲側(cè)腭突上抬誘導(dǎo)昆明小鼠腭裂的發(fā)生。這將為科研工作者對腭裂畸形發(fā)病原因及發(fā)病機制等的研究提供穩(wěn)定高效的昆明小鼠腭裂模型。

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