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    益氣養(yǎng)陰生精方對微波輻射大鼠精子凋亡的影響

    2015-12-19 07:14:02羅少波李昌成劉洪源徐少強胡海翔
    關(guān)鍵詞:附睪睪丸精子

    羅少波,李昌成,劉洪源,孫 靜,徐少強,胡海翔

    (1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū),北京 102638;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市包鋼第三職工醫(yī)院泌尿外科,內(nèi)蒙古 包頭 014010;3.黑龍江省大慶市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)二科,黑龍江 大慶 163515;4.中國人民解放軍空軍總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,北京 100142)

    隨著科技的發(fā)展,雷達、通訊、電腦電視等電磁微波輻射污染越來越嚴(yán)重。生殖系統(tǒng)是對微波輻射比較敏感的系統(tǒng),從精原干細(xì)胞到精子成熟的過程中,任一環(huán)節(jié)遭受過量的微波輻射均可導(dǎo)致精子的異常。國內(nèi)外的研究[1-3]表明,微波輻射對精子密度、畸形率和精子活動力均有一定的影響,但其對精子形態(tài)的影響研究較少。目前,電鏡是精子形態(tài)學(xué)檢測最客觀可信的依據(jù)[4]。本研究對接受大劑量微波輻射的大鼠精子進行透射電鏡觀察,了解精子超微結(jié)構(gòu)的變化,為研究微波輻射對精子形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的影響提供病理形態(tài)學(xué)依據(jù)。

    1 材料

    1.1 實驗動物與分組 健康7周齡雄性Wistar大鼠72只,體質(zhì)量(250±20)g,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2013-0038。按體質(zhì)量將其隨機分為空白對照組(對照組)、高劑量1次輻射組(輻射組)、高劑量1次輻射加中藥組(中藥組),每組各24只。

    1.2 主要儀器與試劑 微波模擬源:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院核輻射防護研究室提供;離心機:德國Hermle公司生產(chǎn),HERMLE2360K 型;WL-9000精子分析儀:北京偉力科技有限公司;細(xì)胞凋亡試劑盒:武漢博士德生物工程公司產(chǎn)品,批號 MK1023;精子孵育液:含有10mmol/L HEPES、140mmol/L NaCl、2.5mmol/L CaCl2,pH 值=7.4。

    1.3 益氣養(yǎng)陰生精方[5]為本課題組治療少精子癥的常用有效方劑,主要由生黃芪、太子參、枸杞子等組成。取中藥720g用7倍水浸泡1.5h,煎煮30 min,藥渣用4倍水煎煮20min,最后二者混合濃縮成240mL。

    2 方法

    2.1 輻射及中藥干預(yù)方法 微波輻射方法參考文獻[6]的方案進行。

    2.1.1 對照組 大鼠只置于輻射臺上15min,不予輻照,常規(guī)飼養(yǎng),自由攝取食水。

    2.1.2 輻射組 取12只大鼠置于反射系數(shù)近似零的微波暗室,接受全身均勻輻照1次。輻照強度100mW/cm2,輻照時間15min,輻照環(huán)境溫度穩(wěn)定于(18±2)℃,濕度50%~70%。將大鼠從輻射室取出,每組6只置于飼養(yǎng)籠中,常規(guī)飼養(yǎng),自由攝取食水。待輻射箱溫度降至18℃后,對剩下的12只大鼠進行相同處理。

    2.1.3 中藥組 輻射方法同輻射組。輻射后第1天開始,每日8:00—9:00,按30g/kg灌服益氣養(yǎng)陰生精方湯劑1次,持續(xù)7d。常規(guī)飼養(yǎng),自由攝食攝水。

    2.2 取材 于輻射后第14天頸椎脫臼法處死實驗大鼠,迅速分離睪丸、附睪,摘除脂肪組織,分析天平稱取質(zhì)量。左側(cè)睪丸、附睪橫切為大致相等的兩半,一半以蘇木素-伊紅染色,切片厚5μm,行組織學(xué)觀察;另一半以5%多聚甲醛固定備用。右側(cè)睪丸、附睪以一縱兩橫法剪為大致均勻6段,置于10mL精子孵育液中孵育30min,小心將上層液體(含精子)移至另一試管中備用。

    2.3 精液常規(guī)檢查 將上述所得精液吸取約100 μL,用WEILI-9000電腦精液自動分析儀測量精子密度。

    2.4 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)法檢測精子凋亡 睪丸置于10%中性甲醛中固定24h,常規(guī)石蠟包埋、切片(4 μm),將已固定的標(biāo)本轉(zhuǎn)入0.5%Triton X-100中,37℃透化胞膜1h;清洗液為加入0.3%小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS),清洗后,再將標(biāo)本放入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和生物素標(biāo)記核苷酸的混合液中,37℃孵育1h;清洗后轉(zhuǎn)入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC)標(biāo)記的鏈霉親合素中,37℃孵育20min,最后將標(biāo)本移入50μg/mL碘化丙啶中復(fù)染15min。熒光顯微鏡下觀察,細(xì)胞核中有棕黃顆粒者即為凋亡細(xì)胞。陰性對照組以PBS代替末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液。精子凋亡率計算:每張切片取5個高倍視野,共計數(shù)500個細(xì)胞,求得陽性凋亡細(xì)胞率。

    2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)”進行統(tǒng)計學(xué)描述。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間均數(shù)多重比較應(yīng)用SNK檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 各組每毫升睪丸組織上層培養(yǎng)液中精子總數(shù)和活躍精子數(shù)比較 與對照組比較,輻射組每毫升上層培養(yǎng)液中精子總數(shù)和活躍精子數(shù)均顯著減少(P<0.05);與輻射組比較,中藥組每毫升上層培養(yǎng)液中精子總數(shù)和活躍精子數(shù)顯著升高(P<0.05)。見表1。

    3.2 各組精子凋亡率比較 與對照組比較,輻射組大鼠精子凋亡率顯著升高(P<0.05);與輻射組比較,中藥組大鼠精子凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表1、圖1。

    表1 各組精子凋亡率和每毫升睪丸組織上層培養(yǎng)液中精子總數(shù)、活躍精子數(shù)比較(±s)

    表1 各組精子凋亡率和每毫升睪丸組織上層培養(yǎng)液中精子總數(shù)、活躍精子數(shù)比較(±s)

    注:同列含有相同右上標(biāo)符號的組別相比較,P>0.05;同列不含相同右上標(biāo)符號的組別相比較,P<0.05。

    對照 24 16.7±5.1* 4.29±1.71* 15.6±2.3*輻射 24 13.8±4.2# 2.57±1.16# 30.5±3.6#中藥 24 25.6±7.5△ 6.74±1.42△ 18.7±4.5△

    4 討論

    眾多的研究表明,睪丸是微波輻射最敏感的靶器官之一[7],精子是雄性遺傳信息的傳遞者,微波輻射可引起睪丸和附睪中精子形態(tài)異常的數(shù)量顯著增多,附睪精子活力下降、畸形率增加、超微結(jié)構(gòu)、遺傳物質(zhì)損傷[8],造成生殖能力下降,而且可能將畸變遺傳給子代。

    在機體內(nèi)部隨時都在發(fā)生著細(xì)胞的死亡,傳統(tǒng)上用顯微鏡來觀察細(xì)胞的死亡,其特征為核染色質(zhì)的濃縮及碎片形成,但這種現(xiàn)象出現(xiàn)很晚,時間也很短暫。凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活,細(xì)胞自身的染色質(zhì)或DNA被切割,出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口,并產(chǎn)生與DNA斷點數(shù)目相同的3′-OH末端,末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶可將地高辛標(biāo)記的dUTP(DIG-dUTP)標(biāo)記至3′-OH末端,DIG-dUTP結(jié)合在DNA斷點部位,可以通過生物標(biāo)記的抗地高辛抗體反應(yīng)后,再結(jié)合鏈霉親和素-FITC。FITC在490~495nm激化,在520~530nm發(fā)射熒光,呈黃綠色,凋亡的細(xì)胞核呈黃綠色,從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細(xì)胞,稱為TUNEL法。TUNEL法實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法,對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進行原位染色,能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征,可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞形態(tài)測定,并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞,因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用[9-11]。

    本課題組經(jīng)常去中國人民解放軍空軍及雷達基地進行調(diào)研,對經(jīng)常接受雷達微波輻射的基層官兵相關(guān)體檢資料進行分析后認(rèn)為,微波輻射屬火熱之邪,微波輻射作用于人體后首先耗傷人體之氣,衛(wèi)氣受損,火熱內(nèi)傳,消灼體內(nèi)之津液,導(dǎo)致陰液不足,微波輻射損傷的致病機制在于氣損及陰、氣陰兩傷,最終造成腎之真陰及元氣的損傷,直接影響人類的生殖系統(tǒng)。針對其發(fā)病機制,治療應(yīng)以益氣養(yǎng)陰生精為基本法則,通過補益氣血陰液而使精氣得到改善,并以益氣養(yǎng)陰生精方為基礎(chǔ)方進行辨證論治,在臨床中得到較好的治療效果。本實驗結(jié)果證實,益氣養(yǎng)陰生精方可以增加微波輻射損傷的精子總數(shù)和活躍精子數(shù),降低微波輻射增加的精子凋亡率,從而改善微波輻射后大鼠的精子質(zhì)量,達到提高微波輻射后大鼠的生殖能力的效果。

    [1]王水明,彭瑞云,高亞兵,等.安多霖對微波輻射大鼠附睪精子參數(shù)的影響[J].中國生育健康雜志,2012,23(3):191-194.

    [2]薛蕾,陳浩宇,王水明.亞急性微波輻射對大鼠精子運動參數(shù)及畸形率的影響[J].環(huán)境與健康雜志,2012,29(7):583-586.

    [3]姚斌偉,彭瑞云,王水明.抗輻靈對微波輻射致大鼠精子損傷的防治作用[J].中國體視學(xué)與圖像分析,2012,17(2):149-155.

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    [5]胡海翔,羅少波,孫靜,等.益氣養(yǎng)陰生精方對微波輻射雄性大鼠生殖的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2013,36(4):250-253.

    [6]胡海翔,羅少波,孫靜,等.微波輻射對雄性大鼠生殖系統(tǒng)的影響[J].中國男科學(xué)雜志,2012,26(11):12-14.

    [7]周文,楊進清,王虛步,等.微波輻射對大鼠睪丸P450 scc mRNA表達水平的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2005,27(2),72-74.

    [8]高曉芳,王水明,彭瑞云.電磁輻射對睪丸及附睪精子生物學(xué)效應(yīng)的研究現(xiàn)狀[J].中華男科學(xué)雜志,2007,13(9):826-829.

    [9]董靜,李明珠,畢克濱,等.原位末端標(biāo)記法檢測齊墩果酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實驗研究[J].中醫(yī)藥信息,2013,3(3):134-135.

    [10]顧文彪,張儀,劉和香,等.原位末端標(biāo)記法觀察釘螺細(xì)胞凋亡的研究[J].中國人獸共患病學(xué)報,2013,29(5):456-459.

    [11]方健,裴少保,吳健,等.兔脊髓沖擊傷后神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2及Bax基因表達與原位末端標(biāo)記法檢測凋亡的比較[J].中國骨與關(guān)節(jié)損傷雜志,2011,26(11):995-997.

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