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    溫腎養(yǎng)血方對(duì)無(wú)排卵模型大鼠卵巢質(zhì)量和形態(tài)的影響

    2015-12-19 07:14:08辛明蔚張秋霞楊亦龍何軍琴梁欣韞尹曉丹
    關(guān)鍵詞:卵泡卵巢子宮

    辛明蔚,張秋霞,趙 暉,楊亦龍,何軍琴,梁欣韞,張 瑩,楊 維,武 穎,尹曉丹

    (1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中醫(yī)科,北京 100026;2.首都醫(yī)科大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100069;3.首都醫(yī)科大學(xué),北京 100069)

    溫腎養(yǎng)血方是北京婦產(chǎn)醫(yī)院中醫(yī)科趙松泉教授的經(jīng)驗(yàn)方,臨床應(yīng)用30余年,療效顯著[1-3]。為進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)利用無(wú)排卵大鼠動(dòng)物模型,以溫腎養(yǎng)血方進(jìn)行干預(yù),通過(guò)觀察大鼠子宮和卵巢質(zhì)量、卵巢形態(tài)學(xué)等相關(guān)指標(biāo),闡明溫腎養(yǎng)血方促進(jìn)卵泡發(fā)育的作用。

    1 材料

    1.1 藥物 實(shí)驗(yàn)用中藥飲片購(gòu)自北京同仁堂股份有限公司。溫腎養(yǎng)血方為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院趙松泉主任醫(yī)師自擬方,由柴胡、香附、木香、赤芍、澤蘭、益母草、牛膝、雞血藤、紅花、丹參、當(dāng)歸、川芎、蒲黃、熟地黃、淫羊藿、山茱萸、菟絲子、枸杞子、覆盆子、鹿角、羌活、細(xì)辛、肉蓯蓉等組成。水煎后濃縮成含生藥2.6g/mL的藥液,4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩h蹤此崧让追移?,每?0mg,高特制藥有限公司·塞浦路斯生產(chǎn),產(chǎn)品批號(hào)為ED104。

    1.2 儀器 JA-1003電子分析天平:上海精科天平廠(chǎng);LEICA RM2235輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī),LEICA HI1210攤片機(jī),LEICA EG1150H 包埋機(jī):德國(guó);Nikon生 物 顯 微 鏡,NIS-Elements Basic Research圖像采集分析系統(tǒng):日本。

    2 方法

    2.1 動(dòng)物分組及模型復(fù)制 將50只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組,溫腎養(yǎng)血方大、中、小劑量組,西藥組,每組10只。另取22日齡大鼠10只作為正常組。

    無(wú)排卵大鼠模型[4](即雄激素致不孕大鼠模型)的復(fù)制:取9日齡SPF級(jí)雌性SD大鼠,于頸背部皮下注射丙酸睪酮1.25mg(0.05mL),至70日齡時(shí)陰道開(kāi)口。連續(xù)陰道涂片2個(gè)性周期(每個(gè)性周期為5d),陰道上皮無(wú)性周期變化,提示無(wú)排卵大鼠模型復(fù)制成功。同樣,取9日齡雌性SD大鼠10只(正常組),于頸背部皮下注射等量蒸餾水,至70日齡時(shí)陰道開(kāi)口。實(shí)驗(yàn)組及正常組均于22日齡時(shí)斷奶,利用自然光照,室溫維持在20℃左右,同樣條件飼養(yǎng),由專(zhuān)人飼養(yǎng)。

    2.2 給藥方法 模型動(dòng)物分組完成后,從80日齡起,分別給予相應(yīng)藥物。模型組和正常組給予12 mL/kg蒸餾水。西藥組給予5.8mg/kg(臨床等效劑量)枸櫞酸氯米芬蒸餾水混懸液,每日灌胃1次,5d停藥。溫腎養(yǎng)血方小、中、大劑量組分別給予溫腎養(yǎng)血方13、26、52mg/kg,分別相當(dāng)于成人臨床劑量的3.5、7.0、14.0倍,每日灌胃1次,連續(xù)21d。

    2.3 取材方法 各組大鼠連續(xù)灌胃結(jié)束后,斷頭處死,取出子宮、雙側(cè)卵巢,去掉周?chē)窘M織,將子宮、卵巢迅速置于電子天平,稱(chēng)質(zhì)量,計(jì)算子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)。

    2.4 卵巢組織切片的制備 以上摘取的卵巢,置于4%多聚甲醛固定8~24h,脫水,透明,石蠟包埋,連續(xù)切片,片厚5μm,用于蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。

    2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。由于這是單因素非平衡設(shè)計(jì)的組合實(shí)驗(yàn),故按研究目的分成3個(gè)組合。①正常組、模型組:采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量指數(shù),采用 Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較子宮指數(shù);②模型組和溫腎養(yǎng)血方大、中、小劑量組:采用單因素方差分析比較多組均數(shù),采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)的多重比較;③西藥組和溫腎養(yǎng)血方大、中、小劑量組:采用單因素方差分析比較多組均數(shù),采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)的多重比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 模型因素對(duì)大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響 與正常組比較,模型組大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化(P>0.05),子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 模型因素對(duì)大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響(±s)

    表1 模型因素對(duì)大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響(±s)

    注:與正常組比較,P<0.05。

    組別 n 體質(zhì)量/g子宮指數(shù)/(g/k g)卵巢指數(shù)/(g/k g)正常1 0 2 3 8.5 8±1 8.2 9 2.4 1±1.1 4 0.7 6±0.1 4模型 1 0 2 4 5.9 6±1 7.8 8 1.3 8±0.3 0* 0.4 0±0.0 8*

    3.2 藥物治療對(duì)無(wú)排卵模型大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響 與模型組比較,各治療組大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)均無(wú)明顯變化(P>0.05);各治療組之間體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)比較,差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

    表2 藥物治療對(duì)無(wú)排卵模型大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響(±s)

    表2 藥物治療對(duì)無(wú)排卵模型大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響(±s)

    組 別 n 體質(zhì)量/g子宮指數(shù)/(g/k g)卵巢指數(shù)/(g/k g)模 型1 0 2 4 5.9 6±1 7.8 8 1.3 8±0.3 0 0.4 0±0.0 8西 藥 1 0 2 1 4.0 5±1 9.5 6 1.3 1±0.2 8 0.4 0±0.0 8溫腎養(yǎng)血方(大) 1 0 2 3 8.9 6±1 8.5 7 1.4 2±0.2 4 0.4 0±0.0 6溫腎養(yǎng)血方(中) 1 0 2 4 3.9 0±1 0.7 1 1.3 4±0.2 0 0.4 2±0.0 7溫腎養(yǎng)血方(?。? 0 2 3 4.4 7±1 4.9 0 1.3 6±0.2 0 0.4 0±0.0 5

    3.3 各組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)比較 正常組大鼠卵巢組織明顯增大,部分卵巢表面有紅斑,各級(jí)生長(zhǎng)發(fā)育都可見(jiàn),卵泡數(shù)目較多,可見(jiàn)不同發(fā)育期卵泡及優(yōu)勢(shì)卵泡,未見(jiàn)囊性擴(kuò)張卵泡。卵巢表現(xiàn)出較多黃體,說(shuō)明卵巢已有排卵。模型組及溫腎養(yǎng)血方小劑量組卵巢體積較小,卵巢表面蒼白,無(wú)斑點(diǎn),色澤蒼白,卵泡數(shù)目少,卵泡較小,且形狀不規(guī)則,多呈囊性擴(kuò)張,內(nèi)含大量漿液性物質(zhì),腔內(nèi)無(wú)卵丘及卵細(xì)胞,卵泡壁顆粒層細(xì)胞稀疏,層次明顯減少,無(wú)黃體。西藥組大鼠卵巢可見(jiàn)不同發(fā)育期卵泡,體積雖大但形狀不規(guī)則,細(xì)胞結(jié)構(gòu)較紊亂,周?chē)该鲙Ш癖〔痪鶆颍w粒細(xì)胞層次減少,少量黃體形成。黃體細(xì)胞排列松散紊亂。溫腎養(yǎng)血方大、中劑量組大鼠卵巢的結(jié)構(gòu)明顯改善,多數(shù)卵巢可見(jiàn)發(fā)育期的各級(jí)卵泡,擴(kuò)張卵泡的顆粒層增厚,卵泡發(fā)育,卵泡內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰,可見(jiàn)卵丘、卵細(xì)胞及典型黃體形成,黃體細(xì)胞大而圓,胞漿豐富。間質(zhì)腺較模型組明顯增多。見(jiàn)圖1。

    4 討論

    王冰曰:“腎氣全盛,沖任脈通,經(jīng)血漸盈,應(yīng)時(shí)而下,沖為血海,任主胞胎,二脈相資,故能有子。”腎陰癸水是經(jīng)血的物質(zhì)基礎(chǔ),血是月經(jīng)的主要成分。腎氣封藏有度,肝氣疏泄有序,經(jīng)血通過(guò)經(jīng)脈,匯于血海,達(dá)于胞宮,血充氣暢,應(yīng)時(shí)而下。沖任二脈隸屬肝腎,肝藏血,腎藏精,乙癸同源,精血互生,脾統(tǒng)血,為后天之本,氣血生化之源。女子又以肝為先天,以血為本。溫腎養(yǎng)血方中淫羊藿、肉蓯蓉、鹿角溫補(bǔ)腎陽(yáng),且溫而不燥,潤(rùn)而生精;女貞子、覆盆子、枸杞子、山茱萸、菟絲子滋補(bǔ)肝腎之陰,同時(shí)取“陰中求陽(yáng)”之意;柴胡、木香、香附疏肝解郁理氣;丹參、赤芍、生蒲黃、雞血藤、紅花、當(dāng)歸、益母草補(bǔ)血活血,疏通經(jīng)脈,化瘀生新;劉寄奴、蘇木祛瘀通絡(luò);牛膝引藥下行,走而能補(bǔ),使氣血得以暢行。以上諸藥意在補(bǔ)肝腎之精,使氣舒精足血暢,卵子成熟排出,月經(jīng)如期而至,以攝精成孕。

    卵泡的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,從原始卵泡開(kāi)始發(fā)育到優(yōu)勢(shì)卵泡的形成需要大約1年的時(shí)間。依次經(jīng)過(guò)始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡及排卵前卵泡4個(gè)階段。無(wú)排卵多表現(xiàn)為卵泡在排卵前的閉鎖。Flerko等[5]認(rèn)為卵泡膜毛細(xì)血管血流量的減少在導(dǎo)致大多數(shù)卵泡于竇前期閉鎖中發(fā)揮重要作用。有研究證實(shí),與正常婦女相比,不孕癥患者卵巢動(dòng)脈舒張期血流呈高阻抗、無(wú)成熟卵泡且卵巢甾體激素變化無(wú)規(guī)律,提示卵泡發(fā)育障礙、無(wú)排卵及不育患者存在卵巢血液供應(yīng)障礙,且生殖器官血液供應(yīng)與卵泡發(fā)育和生殖內(nèi)分泌水平密切相關(guān)[6-7]。溫腎養(yǎng)血方于補(bǔ)腎藥物中配伍大劑量的補(bǔ)血活血藥物,其促進(jìn)卵泡發(fā)育的作用機(jī)制可能與促進(jìn)卵巢局部血液循環(huán),影響卵巢的旁分泌和自分泌功能有關(guān)。方中雞血藤,陸象咸云:“曾見(jiàn)婦人合藥服之,多年不育者,后皆有子?!保ā侗静菥V目拾遺》)《本草綱目》曰:“澤蘭走血分,故能治水腫,涂癰毒,破瘀血,消癥瘕,而為婦人要藥。”藥理學(xué)研究[8]表明,澤蘭水煎劑能對(duì)抗體外血栓形成,有輕度抑制凝血系統(tǒng)與增強(qiáng)纖溶活性的作用?!侗静菝审堋分^蒲黃“味甘,氣平,無(wú)毒,血病必用,消瘀血凝積、癥瘕崩帶殊功,調(diào)女人月候不勻,去產(chǎn)婦兒枕作痛”。藥理學(xué)研究表明,蒲黃水浸液、煎劑或50%乙醇浸液均有促進(jìn)凝血作用,且作用顯著而持久。蒲黃多種制劑能夠降低血壓、減輕心臟負(fù)荷,增加冠脈血流量,改善微循環(huán),提高機(jī)體耐低氧能力,減輕心肌缺血性病變?!侗静輦湟分^牛膝“補(bǔ)肝腎,瀉惡血?!薄端幮越狻吩唬骸耙婺副竟χ窝?,故入諸陰之經(jīng)。行血而不傷新血,養(yǎng)血而不滯瘀血,所以為胎產(chǎn)圣藥。”藥理學(xué)研究[9]表明,丹參能改善血液流變性,降低血液黏度,抑制血小板和凝血功能,激活纖溶,對(duì)抗血栓形成。本方中配伍羌活、細(xì)辛兩味辛溫藥物,頗有深意。隋·巢元方《諸病源候論·婦人雜病諸候》中認(rèn)為,女子不孕有內(nèi)外兩方面因素。內(nèi)因是勞傷氣血,正虛方使邪氣有機(jī)可乘,“婦人挾疾無(wú)子,皆由勞傷血?dú)猓錈岵徽{(diào),而受風(fēng)寒客于子宮,致使胞內(nèi)生病,或月經(jīng)澀閉,或崩血帶下,致陰陽(yáng)之氣不和,經(jīng)血之行乖候,故無(wú)子”。外因是六淫邪氣直中胞宮?!白优K冷無(wú)子者,由將攝失宜,飲食不節(jié),乘風(fēng)取冷,或勞傷過(guò)度,致風(fēng)冷之氣乘其經(jīng)血,結(jié)于子臟,故使無(wú)子”。認(rèn)為風(fēng)寒之邪入內(nèi)客于胞宮,可致宮寒。血得寒則凝結(jié),沖任、胞宮受損,導(dǎo)致月水不利或不通,則不能攝精成孕。指出正氣虧虛、風(fēng)寒外侵是導(dǎo)致宮寒不孕的病機(jī)。因此,溫腎養(yǎng)血方中配伍祛風(fēng)散寒的羌活、細(xì)辛可以去除沉疴痼疾,鼓動(dòng)“腎間動(dòng)氣”,打通沖任二脈?!侗静萁?jīng)疏》曰:“羌活性溫,味辛、苦,氣厚于味,浮而升,陽(yáng)也。手足太陽(yáng)行經(jīng)風(fēng)藥,并入足厥陰、少陰經(jīng)氣分。女子疝瘕者,寒濕乘虛中腎家所致也,苦能燥濕,溫能澼寒,辛能發(fā)散,寒濕去而腎臟安,故主女子疝瘕,及療諸賊風(fēng),百節(jié)痛風(fēng)無(wú)久新也?!笔Y昌烈[10]臨床發(fā)現(xiàn),不論何部位,只要在活血化瘀藥中加入細(xì)辛,可增強(qiáng)鎮(zhèn)痛與活血逐瘀作用。其曾對(duì)照觀察四肢骨折、脫位及身體各部位軟組織損傷之腫痛較重者55例,加用細(xì)辛者較單用活血化瘀藥者疼痛減輕快,瘀腫消退快。

    本研究結(jié)果表明,模型復(fù)制后大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化,大鼠子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)明顯降低(P<0.05)。各治療組大鼠子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)較模型組無(wú)明顯變化(P>0.05),可能與樣本量小有關(guān)。有研究[11]表明,丹參具有促進(jìn)卵泡發(fā)育和減少細(xì)胞凋亡的作用,能夠提高卵泡存活率。文獻(xiàn)[12]報(bào)道淫羊藿可增加小鼠子宮質(zhì)量。肉蓯蓉能增強(qiáng)下丘腦-垂體-卵巢的促黃體功能,使大鼠子宮質(zhì)量比對(duì)照組明顯增加[11]。菟絲子、紅花、丹參、肉蓯蓉等中藥可提高血清雌激素水平,但淫羊藿、女貞子、川牛膝可使血清雌激素水平有所下降[13]。以上這些研究提示,中藥復(fù)方作用機(jī)制和靶點(diǎn)可能是復(fù)雜的、綜合的、系統(tǒng)的,中藥復(fù)方的各種成分一起作用維持機(jī)體平衡,達(dá)到陰陽(yáng)平衡,單一研究某種藥物的作用機(jī)制尚不能完整清楚地闡明中藥復(fù)方的作用機(jī)制。

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