低分子質量核桃多肽抗氧化及抗腫瘤活性研究

許 典 呂 佼 于 超 王豐俊

（北京林業(yè)大學生物科學與技術學院1，北京 100083）（林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室2，北京 100083）

低分子質量核桃多肽抗氧化及抗腫瘤活性研究

許 典1，2呂 佼1，2于 超1，2王豐俊1，2

（北京林業(yè)大學生物科學與技術學院1，北京 100083）（林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室2，北京 100083）

研究了核桃發(fā)酵多肽的抗氧化效果及抗腫瘤活性。結果表明，此多肽具有一定的抗氧化及抗腫瘤活性，當樣品質量濃度為2 mg／mL時其DPPH自由基清除率為91.7%，對人小腸癌細胞（Caco－2）的IC50值為3.67 mg／mL。對4組分發(fā)酵多肽（分子質量＞30、10～30、5～10 ku及＜5 ku）進行抗腫瘤活性的試驗及篩選，發(fā)現(xiàn)＜5 ku組分有較強的抗腫瘤活性，表明低分子質量多肽對Caco－2細胞增殖具有較強的抑制作用（IC50值為2.63 mg／mL），且該樣品不僅抑制Caco－2細胞生長，對人乳腺癌細胞（MCF－7）增殖也有顯著的抑制作用（IC50值為3.76 mg／mL），而對非腫瘤細胞大鼠小腸隱窩上皮細胞（IEC－6）未顯示顯著的抑制作用。以上結果表明，核桃粕發(fā)酵產(chǎn)生的小分子活性多肽有明顯的抗氧化及抗腫瘤活性。

核桃多肽 抗氧化活性 MTT 檢測 抗腫瘤活性

核桃作為重要的木本糧油經(jīng)濟樹種在我國種植面積大，產(chǎn)量可觀［1］。核桃仁不僅營養(yǎng)豐富且味道鮮美，也是多種食品的輔料。核桃仁制油后剩余的核桃粕中的蛋白質消化率較高，氨基酸含量豐富且種類齊全，是一種良好的蛋白質來源。但是，目前我國核桃粕的深加工產(chǎn)品不多，對核桃中豐富的生物活性肽的利用更是不足，以致大量的核桃粕原料無法得到有效利用［2］。

近年來，隨著自由基理論研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)自由基影響很多疾病的發(fā)生發(fā)展，其中就包括癌癥及一些心血管疾病。具備抗氧化效應的活性物質一般具備一定的抗癌效果，說明兩者間存在一定的協(xié)同作用［3］。研究表明，非單一氨基酸形式的小肽類是一種十分重要的生物活性物質，這些小肽具備一定的抗氧化及抗癌活性，且對于人體來說吸收率高于氨基酸，因而擁有比氨基酸更為有效的生理功能［4］?，F(xiàn)在也有關于核桃多肽的研究，但主要集中于制備工藝及其體外抗氧化研究，尚未見關于核桃小肽的抗腫瘤活性研究。本試驗利用制油后的核桃粕制備功能性小肽，并研究其抗腫瘤活性，對科學有效利用核桃蛋白資源，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃粕：北京大山鑫港技術開發(fā)有限責任公司；Caco－2細胞、人乳腺癌細胞MCF－7、大鼠小腸隱窩上皮細胞IEC－6、牛血清白蛋白、細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶：北京協(xié)和細胞資源中心；黑曲霉AS3.350：中科院微生物研究院菌種保藏中心。

3111型 CO2細胞培養(yǎng)箱：Thermo SCIENTIFIC；KHZ－1 357型超凈工作臺：上海市滬西分析儀器廠；KP－629型酶標儀：Thermo SCIENTIFIC。

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃多肽的制備

核桃粕經(jīng)烘干、粉碎、脫脂后制成核桃粕粉，利用黑曲霉液態(tài)發(fā)酵制得核桃多肽液。將核桃多肽粗提液過0.45μm的微孔濾膜，除去大分子物質及雜質，在凍干機中以－90℃冷凍干燥制得核桃多肽粉，放入冰箱中冷藏保存以備用。

1.2.2 核桃多肽樣品的抗氧化試驗

1.2.2.1 核桃多肽清除DPPH自由基能力的測定

以發(fā)酵產(chǎn)核桃多肽及未發(fā)酵核桃原料為樣品，以維生素C為對照，測定核桃粕發(fā)酵前后對DPPH自由基的清除能力影響。

試驗步驟如下：離心管中分別加入2 mL不同濃度梯度的核桃多肽溶液，未發(fā)酵核桃原液和維生素C溶液，再分別加入2 mL DPPH·溶液，混合均勻后避

1.2.2.2 核桃多肽總還原力測定

以發(fā)酵產(chǎn)核桃多肽及未發(fā)酵核桃原料為樣品，以維生素C為對照，測定核桃粕發(fā)酵前后其總還原力的區(qū)別。

分別取1 mL不同濃度的樣品溶液、未發(fā)酵核桃原液和維生素C溶液于10 mL離心管中，加入2 mL磷酸鹽（PBS）緩沖液和2 mL 1%鐵氰化鉀溶液，加入2 mL 10%三氯乙酸溶液，離心，取1.5 mL上清液于10 mL離心管中，加入1.5 mL蒸餾水和0.3 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻，測定其在700 nm處的吸光度值，以A700nm表示樣品的還原能力。以蒸餾水為空白，每個樣品做3個平行試驗，取平均值。

1.2.2.3 核桃多肽清除羥自由基（·OH）活性測定

以發(fā)酵產(chǎn)核桃多肽及未發(fā)酵核桃原料為樣品，以維生素C為對照，測定核桃粕發(fā)酵前后對羥自由基（·OH）的清除能力影響。

試驗步驟如下：在10 mL的離心管中分別加入0.5 mL配好的鄰二氮菲溶液，1 mL磷酸緩沖溶液，0.5 mL不同濃度的樣品溶液、未發(fā)酵核桃原液和維生素C溶液，加入0.5 mL 0.75 mmol／L FeSO4溶液，混勻后再加入H2O2溶液0.5 mL，在536 nm處測定吸光度Ax；將上述步驟中樣品溶液換為蒸餾水，其余不變，測定吸光度Af；將上述步驟中H2O2溶液換為蒸餾水其余步驟不變測定吸光度A0；不加入H2O2，其余步驟不變，測定吸光度As。以蒸餾水為空白，每個樣品做3個平行試驗，取平均值。

1.2.2.4 核桃多肽清除超氧陰離子（O2－）活性測定

以發(fā)酵核桃多肽及未發(fā)酵核桃原料為樣品，以維生素C為對照，測定核桃粕發(fā)酵前后對超氧陰離子（O2－）的清除能力影響。

試驗步驟如下：取0.05 mol／L Tris－HCl緩沖溶液2 mL，加入1 mL不同濃度的樣品溶液、未發(fā)酵核桃原液和維生素C溶液，然后加入配制好的的鄰苯三酚0.5 mL，混勻后在25℃水浴中保溫20 min，然后加入 10 mol／L的鹽酸 0.3 mL，終止反應，在420 nm處測吸光度，得到的數(shù)據(jù)為A；上述步驟中不加入鄰苯三酚其余步驟不變測吸光度值為B；上述步驟中將樣品溶液換成蒸餾水，其余步驟不變，測定吸光度值為C。以蒸餾水為空白，每個樣品做3個平行試驗，取平均值。

1.2.3 細胞培養(yǎng)

1.2.3.1 細胞培養(yǎng)基的準備

本試驗主要討論3種細胞，分別為Caco－2細胞（MEM－EBSS培養(yǎng)基、10%胎牛血清、0.5%雙抗、1%NEAA）；人乳腺癌細胞（MCF－7）（DMEM高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清、0.5%雙抗、1%NEAA）；大鼠小腸隱窩上皮細胞（IEC－6）（DME高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清、0.5%雙抗、胰島素、1%NEAA）

1.2.3.2 細胞培養(yǎng)及傳代

由于試驗中選取的3組細胞均為貼壁細胞，因此細胞培養(yǎng)及傳代的方法基本一致［6］。將買來的細胞通過活化（37℃水?。?、消化（0.05%的胰蛋白酶處理）、終止消化（細胞分層加入培養(yǎng)基）?；靹蚣毎ù荡蚣毎麘腋∫海?、離心（細胞懸浮液冷凍離心）等步驟得到沉淀的細胞。加入新培養(yǎng)基，利用培養(yǎng)液稀釋，控制細胞的濃度在3×104個／mL左右［7］。將細胞分裝至數(shù)個培養(yǎng)皿中繼續(xù)放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)［8］。

1.2.4 MTT試驗

1.2.4.1 接種細胞

將各株細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，進行細胞消化，制得細胞懸濁液，進行細胞計數(shù)（細胞數(shù)／mL＝100小格內(nèi)細胞個數(shù)／100×400×104×稀釋倍數(shù)）［9］根據(jù)所測濃度，將細胞懸液濃度用培養(yǎng)基稀釋至3×104個／mL左右。將細胞懸液接種在96孔板上，除4個邊上的孔不加外，每個孔接種100μL的細胞懸液。每加完1個孔都需要輕晃離心管以保證細胞懸液濃度分布均勻，加完4個孔后用移液槍吹打離心管3～4次。將接種完細胞的96孔板放入CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.4.2 添加核桃多肽樣品

將4種樣品稀釋成不同濃度梯度（1～5 mg／mL），過0.22μm微孔濾膜除菌。按照設計好的加板方式，每孔加入100μL多肽樣品。空白組每孔加入100μL的培養(yǎng)基溶液。每個樣品梯度做3次平行試光反應30min。在517 nm處測定吸光度值。得到的數(shù)據(jù)為A；上述步驟中不加入DPPH·，其余步驟不變B；離心管中分別加入2 mL蒸餾水，再分別加入2 mL DPPH·溶液，測得吸光度值為C［5］。以蒸餾水為空白，每個樣品做3個平行試驗，取平均值。

1.2.4.3 進行MTT檢測

配置MTT溶液，在96孔板中每孔中加入20 μL的MTT溶液。培養(yǎng)4 h后用移液槍吸走上清液后加入200μL的二甲基亞砜（DMSO）。低速震蕩15 min。用酶標儀測量各孔的吸光度值，計算每組多肽樣品對于腫瘤細胞增殖的抑制作用。以核桃多肽樣品濃度為橫軸，抑制率為縱軸繪制抑制腫瘤細胞增殖的量效關系曲線，并計算核桃多肽樣品的IC50值。

式中：A1為試驗孔OD值；A2為對照孔OD值；A0為空白孔OD值。

1.2.5 對不同分子質量的核桃多肽樣品進行抗腫瘤效果試驗

使發(fā)酵產(chǎn)物分別通過30、10、5 ku的超濾膜，將核桃多肽分為＞30、10～30、5～10 ku及＜5 ku等4個組分，測定這4組分對Caco－2細胞增值抑制作用。根據(jù)試驗結果選取效果較好的樣品進行補充試驗。補充試驗選用MCF－7細胞和IEC－6細胞。

1.2.6 統(tǒng)計分析

每組數(shù)據(jù)均用平均值±標準差來表示。通過SPSS軟件從單一方差分析的變化來評價不同組數(shù)據(jù)中的統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計學意義P＜0.05視為顯著［11］。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，通過SPSS軟件對所得數(shù)據(jù)進行配對T檢驗。

2 結果與討論

2.1 核桃粕發(fā)酵前后抗氧化活性變化

圖1a為發(fā)酵前后核桃粕清除DPPH自由基能力的測定結果，圖1b為發(fā)酵前后核桃粕的總還原力測定結果，圖1c為發(fā)酵前后核桃粕清除羥自由基活性測定結果，圖1d為發(fā)酵前后核桃粕清除超氧陰離子（O2

－·）活性測定結果。由圖1a～圖1d可以看出，原料核桃粕的抗氧化效果不顯著，而經(jīng)發(fā)酵后樣品抗氧化效果顯著增加。以清除DPPH自由基能力為例，樣品質量濃度在30 mg／mL時，對DPPH自由基的清除效果顯著增加（見圖1，P＜0.05）且清除率與樣品濃度有一定的量效關系。此結果與邵元龍等［12］對芝麻蛋白水解多肽的抗氧化活性的研究結果相符，連偉帥等［13］對沙棘籽酶解多肽的抗氧化活性研究也有相似結論。結合其余3抗氧化數(shù)據(jù)得出結論，核桃粕經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后抗氧化效果顯著增加，可能與發(fā)酵過程產(chǎn)生了小分子肽類物質有關。

圖1 核桃粕發(fā)酵前后抗氧化活性變化

2.2 發(fā)酵前后核桃原料的抗腫瘤效果對比

為研究核桃粕發(fā)酵產(chǎn)物對Caco－2細胞增殖的影響，分別用核桃粕及其發(fā)酵產(chǎn)物進行細胞增殖分析。結果表明，未經(jīng)處理核桃粕對細胞增殖無明顯影響，但經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)物顯示出極強的細胞增殖抑制作用。發(fā)酵產(chǎn)物對Caco－2細胞生長抑制作用呈一定的劑量依賴性，以1 mg／mL和2 mg／mL質量濃度作用于細胞時，未顯示明顯的增殖抑制作用，當劑量提高到4 mg／mL以上時，出現(xiàn)極其顯著抑制細胞生長作用（見圖2，P＜0.01），對細胞增殖的抑制率高達70%。計算核桃粕發(fā)酵產(chǎn)物對Caco－2細胞增殖抑制作用的IC50值為3.66 mg／mL。以上結果表明，核桃粕經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)生能抑制Caco－2細胞增殖的活性成分。

圖2 核桃粕發(fā)酵前后對Caco－2細胞增殖的影響

2.3 不同多肽樣品對Caco－2細胞的抑制作用

選取分子質量 ＞30、10～30、5～10及 ＜5 ku的4種核桃多肽作為樣品，測定這4種樣品對Caco－2細胞的增殖抑制作用。結果表明，4種樣品均對Caco－2細胞具有一定的生長抑制作用（見圖3）。其中＞30、10～30、5～10 ku 3種樣品在質量濃度 ＜3 mg／mL時對細胞增殖抑制作用并不明顯，當質量濃度為4 mg／mL和5 mg／mL時，會在一定程度上抑制細胞增殖（見圖3，P＜0.05）其中5～10 ku樣品對Caco－2細胞增殖抑制作用的IC50值為3.31 mg／mL（見表1）。

圖3 不同多肽樣品對于Caco－2細胞的抑制作用效果

分子質量＜5 ku樣品對Caco－2細胞具有明顯的生長抑制作用，其IC50值為2.63 mg／mL，并呈一定的劑量依賴性（見圖3）。當樣品質量濃度為1mg／mL和2 mg／mL時，對細胞增殖抑制作用并不明顯，當質量濃度為3 mg／mL時，顯示出顯著抑制細胞增殖作用（P＜0.05），當質量濃度為4 mg／mL和5 mg／mL時，會極其顯著抑制細胞增殖（P＜0.01）。樣品對Caco－2細胞增殖抑制作用的IC50值為2.63 mg／mL。不同分子質量的核桃多肽均對Caco－2細胞的增值有抑制作用，但不同樣品對Caco－2細胞增殖抑制效果不盡相同，分子質量＜5 ku樣品的抑制效果最強，表明抑制Caco－2細胞增殖的活性成分含量較高。

表1 不同分子質量樣品的IC50值／mg／mL

2.4 不同濃度A4（＜5 ku）多肽樣品對MCF－7細胞增殖抑制作用

為進一步研究＜5 ku樣品對其他腫瘤細胞生長的影響，以人乳腺癌細胞株MCF－7為研究模型，同樣在1、2、3、4及5 mg／mL的質量濃度水平下，檢測樣品對細胞增殖的影響。MTT細胞增殖試驗結果表明，＜5 ku樣品對MCF－7細胞也具有明顯的生長抑制作用，其IC50值為3.64mg／mL，并呈一定的劑量依賴性（見圖4）。當分子質量＜5 ku樣品質量濃度為1～3mg／mL時，對細胞增殖有抑制作用但并不明顯；當質量濃度為4 mg／mL時，顯著抑制細胞增殖（P＜0.05）；當質量濃度為5 mg／mL時，會極其顯著抑制細胞增殖（P＜0.01）。以上結果表明，＜5 ku樣品對MCF－7細胞具有一定的增殖抑制作用，但對Caco－2細胞的增殖抑制作用更強。

圖4 不同濃度A4多肽樣品對MCF－7細胞增殖抑制作用

2.5 不同濃度A4（＜5 ku）多肽樣品對IEC－6細胞增殖抑制作用

為研究分子質量＜5 ku樣品對健康非腫瘤細胞生長的影響，本試驗選擇大鼠小腸隱窩上皮細胞（IEC－6）作為研究模型。IEC－6細胞具有典型的正常腸上皮細胞的形態(tài)特征、生長特性和超微結構，可用于研究正常培養(yǎng)條件下樣品對腸上皮細胞的作用。在1、2、3、4及5 mg／mL的樣品質量濃度水平下，進行 MTT細胞增殖分析試驗。結果表明，小分子質量核桃多肽對IEC－6細胞沒有明顯的生長抑制作用（見圖5），量效關系也不明顯。但在高質量濃度時（5 mg／mL）樣品還是對細胞的增殖產(chǎn)生了一定的抑制作用（35.19%）。

圖5 不同濃度A4多肽樣品對正常IEC－6細胞增殖抑制作用

3 結論

核桃粕原料抗氧化性及對Caco－2細胞增殖的抑制作用較小，但經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，產(chǎn)生小分子多肽類物質，抗氧化性及對Caco－2細胞增殖的抑制作用均有顯著提高。分子質量＜5 ku的核桃多肽樣品不僅對人結腸癌細胞具有生長抑制作用，對人乳腺癌細胞也具有較強生長抑制作用，表明核桃粕經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)生的抑制癌細胞生長的活性成分且分子量較小的肽類樣品抑制效果更好。而且，對癌細胞生長具有較強抑制作用的分子質量＜5 ku的樣品，對正常非腫瘤細胞IEC－6沒有明顯的生長抑制作用。以上結果表明，核桃粕黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物以特定形式存在的小肽類具有一定抗腫瘤活性，符合理想抗腫瘤活性成分所需的高效、低毒副作用特點。該研究結果為闡明核桃蛋白能產(chǎn)生抗腫瘤活性肽提供了依據(jù)，可以作為今后核桃生物活性多肽深度開發(fā)利用的基礎。

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The Antioxidant and Anti－Tumor Abilities of Low－Molecular－WeightWalnut Peptides

Xu Dian1，2LüJiao1，2Yu Chao1，2Wang Fengjun1，2
（College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University1，Beijing 100083）
（Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，Beijing Forestry University2，Beijing 100083）

In the paper，the antioxidant and antineoplastic activity of walnut polypeptide after fermented has been researched.The results showed that the walnut polypeptide had an antioxidant activity and the clearance rate of its DPPH· free radicalwas91.7%at2mg／mL alsowith an inhibition on proliferation of human colon cancer（Caco－2）cells（IC50value of 3.67 mg／mL）.The walnut polypeptide was separated into four fragments，including A1（MW＞30 ku），A2（MW：10～30 ku），A3（MW：5～10 ku）and A4（MW：＜5 ku），to determine the different inhibition on tumor cells.The fragment A4exhibited obvious inhibition（IC50value of2.63 mg／mL）and a certain extent of inhibition on the proliferation ofMCF－7 tumor cells（IC50value of3.76mg／mL）.However，no significant inhibitory effect of the fragment A4was observed on IEC－6 cells.The results indicated that the polypeptide derived from walnut protein cake had antioxidant and antineoplastic activities.

walnut peptide，antioxidant activity，MTT detection，anti－tumor activity

TS201.2

A

1003－0174（2015）11－0065－06

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項（TD2012－03），北京市農(nóng)業(yè)科技項目（20130110）

2014－04－10

許典，女，1989年出生，碩士，油脂與植物蛋白

王豐俊，男，1975年出生，副教授，油脂與植物蛋白