超聲波輔助提取花生紅衣多酚及其抗氧化活性研究

任 虹 薛宏亮 李 婷 朱曉霞

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品添加劑與配料北京高校工程研究中心食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室1，北京 100048）

（武漢大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院2，武漢 430071）

超聲波輔助提取花生紅衣多酚及其抗氧化活性研究

任 虹1薛宏亮2李 婷1朱曉霞1

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品添加劑與配料北京高校工程研究中心食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室1，北京 100048）

（武漢大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院2，武漢 430071）

采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)研究超聲波輔助提取花生紅衣多酚的工藝條件，采用DPPH·法測定其體外抗氧化活性。結(jié)果表明：花生紅衣多酚超聲波輔助最佳提取條件：乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)70%、超聲功率240 W、超聲時(shí)間9 min、超聲溫度50℃；提取因素影響大小順序?yàn)槌暅囟龋境暪β剩境晻r(shí)間；花生紅衣中提取多酚物質(zhì)平均得率為5.89%，與模型預(yù)測值基本相符。與傳統(tǒng)提取方法相比，超聲輔助提取是一種提取花生紅衣多酚的有效方法。花生紅衣多酚具有較強(qiáng)的體外清除DPPH·自由基的能力。

花生紅衣多酚 響應(yīng)面法 超聲波輔助提取 抗氧化活性

花生（Arachis hypogaea）是我國各地廣泛種植的油料作物，花生紅衣（Peanut testa）為花生的種皮，在花生榨油加工生產(chǎn)中，作為經(jīng)濟(jì)效益低的副產(chǎn)物，沒有得到充分綜合利用［1］。多酚類物質(zhì)是花生紅衣中重要的功效成分，與其抗氧化活性密切相關(guān)，大量藥理實(shí)驗(yàn)表明，多酚類化合物具有降血脂、清除自由基等抗氧化活性［2-4］，但目前花生紅衣在加工生產(chǎn)中常常作為廢棄物而被丟棄，若能以花生紅衣為原料，規(guī)?；_發(fā)其中高活性的多酚類物質(zhì)，將有效發(fā)揮其潛在的應(yīng)用價(jià)值和可觀的經(jīng)濟(jì)效益［5-6］。

植物多酚類物質(zhì)的提取通常采用熱回流、溶劑浸泡及堿提酸沉等方法，但多酚類物質(zhì)的提取率均不理想［7-9］。近年來，將超聲波輔助、微波輔助等提取法應(yīng)用于植物細(xì)胞壁的破碎，有效提高了功效成分的提取率，提高了生產(chǎn)效率［10-12］。超聲波輔助提取法是一種提高天然產(chǎn)物功效成分萃取率的新技術(shù)，該技術(shù)利用超聲波輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、擾動(dòng)作用、高速擊碎和攪拌作用等多級效應(yīng)，增大物質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑的穿透力，加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，從而提高目標(biāo)成分的萃取率［13］。目前，超聲波輔助萃取技術(shù)用于花生紅衣功效成分提取的研究報(bào)道還比較少。雖然有些文獻(xiàn)報(bào)道了不同產(chǎn)地的花生紅衣多酚的提取工藝［14-15］，但花生的產(chǎn)地、品種不同，其中多酚的含量、成分及其抗氧化活性各異，本試驗(yàn)選用我國山東省膠東半島產(chǎn)花生紅衣為材料，應(yīng)用超聲波輔助提取法優(yōu)化花生紅衣多酚成分的提取工藝，為多酚類物質(zhì)的開發(fā)和花生紅衣的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生紅衣：山東省蓬萊市當(dāng)?shù)剞r(nóng)場，粉碎過40目篩；焦性沒食子酸（純度＞98%）二丁基羥基甲苯（BHT）、1，1-二苯基 -2-三硝基苯肼（DPPH）：Sigma-Aldrich公司；福林試劑：北京索萊寶科技有限公司；無水Na2CO3：北京五洲世紀(jì)紅星化工有限責(zé)任公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

KQ-400DB數(shù)控超聲儀：自昆山市超聲儀器有限公司；SpectraMax190連續(xù)波長酶標(biāo)儀：Molecular Devices公司；CP224S電子分析天平：Sartorius公司；ALPHA2-4LSC真空冷凍干燥機(jī)：CHRIST公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 花生紅衣多酚提取方法

準(zhǔn)確稱取5.0 g花生紅衣粉末，加入一定濃度乙醇，用超聲波輔助法（選擇一定的超聲時(shí)間、超聲溫度和超聲功率）提取其多酚類成分，抽濾，棄去濾渣得濃縮液，冷凍干燥得多酚粗提物，稱重，備用。

1.3.2 花生紅衣多酚含量測定

1.3.2.1 繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線［14］

準(zhǔn)確配制40 mg／mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0、20、40、80、100、120、140μL上述溶液，以去離子水定容至 10 mL，此時(shí)質(zhì)量濃度分別為 0、80、160、320、400、480、560μg／mL；分別取上述各標(biāo)液20μL于EP管中，各加入500μL去離子水，搖勻后，加入100μL福林試劑后，混勻。再加入200μL 20%Na2CO3溶液，混勻，避光靜置30 min。取100μL上清液于96孔板中，每個(gè)樣品作6個(gè)平行孔，于760 nm下測其吸光度A760值，以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A760為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光度（y）沒食子酸質(zhì)量（x）與之間的關(guān)系為y＝0.000 8x+0.009 6，相關(guān)系數(shù) R2＝0.997 5。

1.3.2.2 花生紅衣多酚含量測定

稱取10.0 mg花生紅衣粉末提取物，加入甲醇10 mL，配制1.0 mg／mL花生紅衣樣品溶液。分別取20μL上述樣品于EP管中，各加入500μL去離子水，搖勻，再加入100μL福林試劑，混勻后，迅速加入200μL 20%Na2CO3溶液，搖勻，25℃ 避光靜置反應(yīng)30 min，取100μL上清液于96孔板中，每個(gè)樣品6個(gè)平行孔，于760 nm下測其吸光度 A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以下公式計(jì)算樣品中多酚物質(zhì)含量。

式中：x為樣品中多酚物質(zhì)含量／%；y為樣品提取液吸光度值A(chǔ)760；m1為花生紅衣多酚粗提物干質(zhì)量／g；m為花生紅衣樣品干質(zhì)量／g。

1.3.3 花生紅衣多酚抗氧化活性

采用DPPH·法測定花生紅衣多酚的抗氧化活性［16］。取0.10 mL不同濃度的花生紅衣多酚溶液，分別加入2.90 mL 0.1 mol／L DPPH·甲醇溶液，室溫靜置30 min后測定517 nm處的吸光度值，同時(shí)，以相同濃度的BHT作為對照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。

式中：Ac為0.1mL甲醇 +2.9 mL DPPH·溶液的對照吸光度值；A為0.1 mL樣品溶液+2.90 mL DPPH·溶液的吸光度值；B為0.10 mL樣品溶液+2.90 mL甲醇的吸光度值。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 6.5軟件繪制單因素試驗(yàn)圖，采用Design-Expert 6.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助提取花生紅衣多酚單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對花生紅衣多酚得率的影響

稱取花生紅衣粉末5.0 g，固定超聲時(shí)間10min、溫度40℃、超聲功率280W、料液比1∶15（g∶mL），選取40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液提取紅衣多酚，考察乙醇濃度對花生紅衣多酚得率的影響，如圖1所示。

圖1表明，隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增加，花生紅衣提取液中的多酚含量不斷增加，當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值。進(jìn)一步升高乙醇濃度，多酚得率逐漸降低，這與提取液中多酚物質(zhì)的溶解性有關(guān)。另外，隨著乙醇濃度的增加，蛋白質(zhì)等生物大分子變性沉淀，使多酚物質(zhì)從組織細(xì)胞向提取溶劑中擴(kuò)散的阻力增大，導(dǎo)致多酚得率降低。因而確定提取花生紅衣多酚類物質(zhì)的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖1 乙醇濃度對花生紅衣多酚得率的影響

2.1.2 料液比對花生紅衣多酚得率的影響

稱取5.0 g花生紅衣粉末，固定超聲時(shí)間10 min、溫度40℃、功率280 W，分別加入20、40、60、80、100 mL 70%乙醇，考察不同料液比對花生紅衣多酚得率的影響，如圖2。

由圖2可知，隨著料液比的增加，多酚得率逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶16（g∶mL）時(shí)，得率達(dá)最高，進(jìn)一步提高溶劑量，多酚得率稍有下降。料液比升高在一定程度上可提高傳質(zhì)推動(dòng)力，但從提取效率、溶劑用量等方面綜合考慮，確定料液比1∶16（g∶mL）較佳，此時(shí)，多酚得率為3.70%，明顯低于圖1多酚得率，可能是由于乙醇純度不同、超聲時(shí)間不足等因素引起的，但曲線的變化趨勢反映了料液比對多酚得率的影響。

圖2 料液比對花生紅衣多酚得率的影響

2.1.3 超聲時(shí)間對花生紅衣多酚得率的影響

固定超聲波功率280W、溫度40℃、料液比1∶16（g∶mL）、體積分?jǐn)?shù) 70%乙醇溶液，分別用 5、10、15、20、25 min超聲時(shí)間提取紅衣多酚，考察超聲時(shí)間對多酚得率的影響，如圖3所示。

由圖3可見，隨超聲時(shí)間的增加，提取液中多酚得率逐漸增大；當(dāng)超聲10 min時(shí)，多酚得率達(dá)最大值；時(shí)間延長至15 min后，多酚得率明顯降低。說明超聲10 min時(shí)多酚已基本提取完全，隨著花生紅衣多酚物質(zhì)在超聲波中處理時(shí)間的增加，可能導(dǎo)致部分多酚物質(zhì)發(fā)生降解，得率降低。因此，初步確定最佳超聲時(shí)間為10 min。

圖3 超聲時(shí)間對花生紅衣多酚得率的影響

2.1.4 超聲溫度對花生紅衣多酚得率的影響

固定超聲波功率280 W、時(shí)間10 min、料液比1∶16（g∶mL）、體積分?jǐn)?shù) 70%的乙醇溶液，分別用超聲溫度40、50、60、70、80℃ 提取紅衣多酚，超聲溫度對多酚得率的影響，如圖4所示。

圖4表明，當(dāng)超聲溫度未達(dá)到50℃時(shí)，多酚物質(zhì)的含量隨溫度的升高而逐漸增加；當(dāng)超聲溫度達(dá)到50℃時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值；之后隨溫度的升高，多酚得率逐漸減少，這是因?yàn)殡S著溫度的升高，提取液中部分多酚物質(zhì)可能發(fā)生分解。由此確定最佳超聲溫度為50℃。

圖4 超聲溫度對紅衣多酚得率的影響

2.1.5 超聲功率對花生紅衣多酚得率的影響

固定超聲時(shí)間10 min、溫度50℃、料液比1∶16（g∶mL）、體積分?jǐn)?shù) 70%乙醇溶液，分別用 160、200、240、280、320W的超聲功率提取紅衣多酚，考察超聲功率對多酚得率的影響，如圖5所示。

圖5可見，隨著超聲功率的提高，多酚得率不斷增加，因?yàn)楣β试礁撸瑢?xì)胞的破壞作用越大，溶劑擴(kuò)散效果越佳，越有利于多酚物質(zhì)的萃出，當(dāng)超聲功率達(dá)240 W時(shí)，多酚得率達(dá)最高值，進(jìn)一步提高功率，多酚得率逐漸下降，可能是由于過高的提取功率產(chǎn)生的瞬間高溫會破壞多酚成分，同時(shí)雜質(zhì)萃出增多。因此，選擇240W為最佳超聲功率。

圖5 超聲功率對紅衣多酚得率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化花生紅衣多酚提取工藝條件

2.2.1 分析因素選擇及分析方案

根據(jù)Box-Benhnken模型的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取超聲時(shí)間X1、超聲功率X2和溫度X3進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，并以 +1、0、-1分別表示自變量的高、中、低水平，多酚得率為響應(yīng)值（目標(biāo)函數(shù)Y），試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面法三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

取15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為12個(gè)析因點(diǎn)和3個(gè)零點(diǎn)，其中，析因點(diǎn)為自變量，取值在X1、X2、X3構(gòu)成的三維頂點(diǎn)上，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)重復(fù)3次，估計(jì)試驗(yàn)誤差。響應(yīng)面分析結(jié)果見表2。

表2 花生紅衣多酚得率響應(yīng)面分析及試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 模型建立與顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 6.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到花生紅衣多酚得率預(yù)測值Y對X1、X2和X3的二次多項(xiàng)回歸方程如下：

式中：X1為超聲時(shí)間；X2為超聲功率；X3為超聲溫度；方程中各項(xiàng)系數(shù)的絕對值直接反映了各因素對多酚得率的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。

回歸方程可信度分析見表3，其中R2＝0.969 4，表明96.94%的數(shù)據(jù)可以此方程來解釋，說明方程可靠性較高。CV值越低，顯示試驗(yàn)穩(wěn)定性越好，本試驗(yàn)中CV值為5.58%，說明試驗(yàn)操作可信。綜上說明了此方程可以用來分析和預(yù)測超聲萃取山東花生紅衣多酚得率的工藝結(jié)果。

表3 回歸方程可信度分析

模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和結(jié)果見表4，表明各因素對多酚得率的影響不同，各因素對模型影響程度大小依次是X3＞X2＞X1，即超聲溫度影響最大，超聲功率次之，超聲時(shí)間影響較少。該分析結(jié)果與方差F值分析結(jié)果一致。

表4 模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y與對應(yīng)的試驗(yàn)因素X1（超聲時(shí)間）、X2（超聲功率）和 X3（超聲溫度）構(gòu)成的一個(gè)三維空間曲面圖，直觀反映了各因素交互關(guān)系對響應(yīng)值Y的影響。當(dāng)特征值為正值時(shí)，響應(yīng)面圖形為山谷形曲面，有最小值存在；當(dāng)特征值為負(fù)值時(shí)，為山丘形曲面，有最大值存在；當(dāng)特征值有正有負(fù)時(shí)，為馬鞍形曲面，無極值存在。等高線形狀反映了各因素交互作用的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素交互作用顯著，而橢圓形與之相反。采用Design Expert 6.0軟件以回歸方程式繪制響應(yīng)面圖和等高線圖，如圖6～圖8所示。

圖6為超聲時(shí)間和功率對多酚得率的影響。由圖6曲面圖可知，當(dāng)超聲溫度一定時(shí)，隨著超聲功率的增加，多酚得率出現(xiàn)先增后減的趨勢，曲線較陡；隨著提取時(shí)間的增加，多酚得率變化不明顯，曲線較平滑；由圖6等高線圖可知，超聲時(shí)間和功率的交互作用不顯著。圖7為超聲時(shí)間和溫度對多酚得率的影響，由圖7曲面圖可知，當(dāng)超聲功率一定時(shí)，隨著超聲溫度的增加，多酚得率逐漸增加；隨著提取時(shí)間的增加，多酚得率曲線較平滑；由圖7等高線圖為橢圓形可知，超聲時(shí)間與溫度的交互作用不顯著。圖8為超聲功率和溫度對多酚得率的影響，曲線較陡，隨著超聲功率和溫度的增加或減小，響應(yīng)值變化較大；由圖8曲面圖可知，當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí)，隨著超聲功率和溫度的增加，多酚得率呈現(xiàn)先增后減的趨勢，曲線較陡；由圖8等高線圖可知，超聲功率與溫度的交互作用顯著。從表4模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和結(jié)果中也可以得到同樣的結(jié)論。

圖6 DH＝f（X1，X2）的響應(yīng)面和等高圖

圖7 DH＝f（X1，X3）的響應(yīng)面和等高圖

圖8 DH＝f（X2，X3）的響應(yīng)面和等高圖

2.2.4 確定最佳工藝條件

由響應(yīng)面分析可知，回歸模型存在最大值，花生紅衣多酚得率的最大值為5.97%，最高點(diǎn)位于試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，最大值對應(yīng)各因素：X1＝9.24，X2＝238.04，X3＝50.54，即花生紅衣多酚超聲波輔助提取的最佳條件為：時(shí)間9.24 min，功率238.04 W，溫度50.54℃。為檢驗(yàn)RSM法的可靠性，采用上述最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際操作條件，將最佳工藝條件修正為：料液比1∶16（g∶mL），70%乙醇、超聲時(shí)間9 min、超聲功率240W、超聲溫度50℃，在此條件下進(jìn)行3平行試驗(yàn)，花生紅衣多酚平均得率為5.93%，與理論預(yù)測值5.97% 基本相符，說明回歸方程能真實(shí)反映各因素對花生紅衣多酚得率的影響，優(yōu)化結(jié)果可靠，對于多酚提取工藝研究具有指導(dǎo)意義。

2.3 超聲波輔助提取與傳統(tǒng)提取方法的比較

分別采用傳統(tǒng)提取法和超聲波輔助提取法的工藝條件提取花生紅衣多酚，結(jié)果見表5。由表5可知，在相同乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間條件下，超聲波輔助提取法獲得的多酚得率（5.93%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)提取法得率（2.80%）。超聲波輔助提取增強(qiáng)了多酚物質(zhì)的溶出和擴(kuò)散，明顯提高了多酚物質(zhì)的提取得率。

表5 超聲波輔助提取法和傳統(tǒng)提取法效果比較

2.4 花生紅衣多酚的抗氧化活性

以BHT作為陽性對照，研究花生紅衣多酚對DPPH·的清除能力，如圖9，在2～30 mg／g濃度范圍內(nèi)，隨著花生紅衣多酚濃度的升高，對DPPH·的清除能力逐漸增高，并呈良好量效關(guān)系；當(dāng)花生紅衣多酚含量為25 mg／g時(shí)，達(dá)到最大清除力，對DPPH·的清除率達(dá)81.2%，直至30 mg／g基本保持不變，明顯強(qiáng)于BHT，可見花生紅衣多酚具有較強(qiáng)的體外清除DPPH·能力。本試驗(yàn)初步研究了花生紅衣多酚對DPPH·的清除能力，其作用機(jī)理有待深入研究。

圖9 BHT、花生紅衣多酚對DPPH·的清除作用

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面分析可以得出，在超聲輔助提取的各影響因素（超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間）中，以超聲溫度對花生紅衣多酚得率的影響最為顯著，各因素間的交互作用明顯，通過軟件優(yōu)化得出超聲波輔助提取花生紅衣多酚的最佳工藝條件為：料液比為1∶16（g∶m L），乙醇體積分?jǐn)?shù)為 70%、超聲功率為240 W、最佳溫度為50℃、超聲時(shí)間為9 min，花生紅衣多酚平均得率為5.93%，與模型預(yù)測值（5.97%）基本相符，可信度高。在相同乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間條件下，超聲波輔助提取的花生紅衣多酚得率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)提取法。因此，超聲波輔助提取法是一種有效提取花生紅衣多酚的方法?？寡趸钚詸z測發(fā)現(xiàn)，花生紅衣多酚體外清除DPPH·的能力強(qiáng)于BHT，花生紅衣多酚具有良好的體外抗氧化活性。

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Ultrasonic-Assisted Extraction of Polyphenols from Peanut Testa and Its Antioxidant Activity

Ren Hong1Xue Hongliang2Li Ting1Zhu Xiaoxia1
（Beijing Technology＆Business University，Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Laboratory for Food Quality and Safety1，Beijing 100048）
（School of Public Health，Wuhan University2，Wuhan 430071）

The extraction technique of polyphenols from peanut seed testa and their antioxidant activity in vitro have been studied.One-factor-at-a-time and response surfacemethodology（RSM）have been applied to optimize the ultrasonic assisted extraction（SAE）of polyphenols from peanut seed testa.The antioxidants activity in vitro were assayed through scavenging effects on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（DPPH）.The results showed that the obtained optimum conditionswere ultrasonic assisted for extraction time 9 min，extraction temperature 50℃and extraction power 240W.The above conditions displayed different effects on polyphenol extraction yields as the following order：ultrasonic assisted extraction temperature＞extraction power＞extraction time.On the optimum condition，the polyphenols extraction yield was 5.93%，which was basically matched with the values predicted by the mathematicalmodel.Compared with traditional extraction，SAE had a better performance to extract polyphenols from peanut seed testa.The polyphenols from peanut seed testa exhibited significant antioxidant activity on scavenging DPPH in vitro，which can be utilized as a source of potential antioxidants.

polyphenols of peanut testa，ultrasonic assisted extraction，polyphenols，antioxidant activity

S565.2；TS209

A

1003-0174（2015）01-0117-07

863計(jì)劃（2011AA060701）

2013-10-09

任虹，女，1967年出生，副教授，天然產(chǎn)物化學(xué)