禽原始生殖細(xì)胞的分離·培養(yǎng)及應(yīng)用

李 璐，李俊杰，2* ，曹 慧，李祥龍(.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定 07000;2.河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北保定07000;.河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島066000)

在胚胎時期主要有2種細(xì)胞具有多向分化潛能，分別是胚胎干細(xì)胞(Embryonc stem cell，ES)和胚胎生殖細(xì)胞(Embryonic germ cell，EG)。前者來源于胚胎早期囊胚階段，后者來源于胚胎生殖嵴的原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell，PGC)——動物生殖細(xì)胞的原始祖先細(xì)胞。在雌性和雄性動物中PGCs可分別形成卵原細(xì)胞和精原細(xì)胞，其在形態(tài)、表面標(biāo)志和分化潛能方面都類似于ES細(xì)胞。另外，由于雞卵中含有大而多的卵黃，其受精后的整個孵化過程需在含有大量卵清的蛋殼內(nèi)進(jìn)行，這些特殊的生理特性使PGCs成為研究禽類胚胎發(fā)生、細(xì)胞分化機(jī)制、發(fā)育相關(guān)調(diào)控基因等研究的良好模型?；诖耍P者對PGCs的特性、分離培養(yǎng)及應(yīng)用等研究研展進(jìn)行了綜述。

1 禽類PGCs的特性

原始生殖細(xì)胞(PGCs)是具有高度未分化的發(fā)育全能性細(xì)胞。將剛分離到的PGCs在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)它比體細(xì)胞體積大，細(xì)胞核較大，位置偏中央，細(xì)胞周圍有明顯光環(huán)，有的具有偽足［1］。此外，PGCs細(xì)胞具有集落的顯著特征，Wentwrth等發(fā)現(xiàn)PGCs細(xì)胞在飼養(yǎng)層上呈集落狀生長，排列緊密，細(xì)胞間界限不清楚，生長特征表現(xiàn)為PGCs集落間常發(fā)生聚集現(xiàn)象。PGCs內(nèi)含有大量的糖原顆粒，并且具有較高的堿性磷酸酶活性，但是已分化的PGCs糖原含量及AKP活性明顯降低［2］。秦潔等研究發(fā)現(xiàn)PGCs憑借其細(xì)胞質(zhì)中大量糖原顆粒的沉積，可通過PAS染色將其余糖原顆粒相對較少的體細(xì)胞區(qū)分，其染色特征為細(xì)胞核不著色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色［3］。經(jīng)過PAS染色后的PGCs細(xì)胞形態(tài)變化不一，有的由圓變長，有的變?yōu)闄E圓形，還有個別PGCs細(xì)胞仍保持圓形，有的還在頂端伸出偽足，核外胞質(zhì)呈現(xiàn)許多深染的區(qū)域［4］。對于禽類PGCs，秦潔等報道其為圓形，HE(Hematoxylin-eosin)染色后精原細(xì)胞為圓形，體積較大，核著色較深;支持細(xì)胞形狀不規(guī)則，有圓形、錐形，體積較精原細(xì)胞小，著色較淺;間質(zhì)細(xì)胞一般成群分布在曲精細(xì)管索之間［5］。

2 PGCs的分離培養(yǎng)

PGCs在禽胚胎的早期發(fā)育過程中有其獨(dú)特的遷移規(guī)律［6］，從而能被分離提取，并可移植到同種胚胎中，發(fā)育成有功能的配子。在血液循環(huán)系統(tǒng)建立后，禽類PGCs首先通過血液循環(huán)到達(dá)原始生殖嵴部位，并在其中分化成配子。根據(jù)禽類PGCs的獨(dú)特遷移路線，通常在以下3個階段進(jìn)行PGCs的分離:①從5期胚的生殖新月區(qū)提取;②從10～13期胚的血液中提取;③從生殖腺中提取。

為了掌握分離PGCs的最適時間，李碧春等比較了孵育48～60 h分離后PGCs的濃度，發(fā)現(xiàn)孵化52～54 h(13～15期)胚胎中PGCs濃度最大(1%以上)，48、56、60 h的雞胚中PGCs濃度較小(1%以內(nèi))，且孵化48 h(12期)的雞胚不容易獲取 PGCs，因此分離 PGCs的時間以孵化52～54 h為宜［7］。

PGCs不同的分離部位，對最終分離效果也有顯著影響。Naeemipour等通過檢測雞胚HH14期(此時大部分PGCs進(jìn)入血液循環(huán))、HH18期(此時PGCs已經(jīng)在血液循環(huán)中停留8～12 h)和HH28期(大部分PGCs遷移到生殖嵴)中PGCs多能性基因表達(dá)譜的變化，發(fā)現(xiàn)Oct4、Sox2、Nanog基因的轉(zhuǎn)錄物不斷減少的現(xiàn)象不是轉(zhuǎn)錄抑制的結(jié)果［8］。與血液PGCs相比，性腺PGCs已經(jīng)失去了形成集落的能力;與哺乳動物PGCs相比，禽類PGCs多能性基因的表達(dá)不斷被抑制，在生殖細(xì)胞系遷移的不同階段多能性逐步喪失。為了保持禽類原始生殖細(xì)胞的多能性，其最優(yōu)分離部位還有待深入研究。

不同的分離方法也直接影響最終分離效果。前人已經(jīng)報道了很多PGCs的分離純化方法［8－10］，但大多數(shù)是用梯度離心法從血液中提?。?－9，11］。體外操作的需要大量的 PGCs，但研究發(fā)現(xiàn)通過此方法提取的PGCs的絕對數(shù)量較少。通過研究PGCs的遷移路線發(fā)現(xiàn)，在原始生殖腺中PGCs相對集中且有大量增殖，是供體外培養(yǎng)PGCs很好的來源。秦潔等［12］報道與Ficoll密度梯度離心法相比酶解離法分離到PGCs的相對數(shù)量較多，存活時間較長，是一種較可行的分離方法。李碧春等也報道酶解法分離到的PGCs的相對數(shù)量較Ficoll密度梯度離心法多，存活時間較長，是一種適宜的分離方法［13］。Alvarez等采用酶解法分離PGCs，但分離產(chǎn)物中體細(xì)胞含量較高，在培養(yǎng)1 h左右這些體細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞可與PGCs協(xié)同競爭生存，并且可分泌大量生長因子，如IGF(Insulin-like growth factor)和EGF(Epidermal growth factor)，有利于PGCs的存活增殖;同時也釋放分化抑制因子，如LIF(Leukemia inhibitory factor)，抑制PGCs分化和凋亡。在基于前人研究的基礎(chǔ)上，還需要對禽類PGCs的分離方法、部位和時間等關(guān)鍵性問題進(jìn)行深入探索。

PGCs的體外培養(yǎng)環(huán)境精確而復(fù)雜，維持其未分化的狀態(tài)是體外培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵。飼養(yǎng)層細(xì)胞及多種細(xì)胞因子在PGCs體外培養(yǎng)技術(shù)中起著舉足輕重的作用。飼養(yǎng)層細(xì)胞(STO細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞/MEF、雞成纖維細(xì)胞/CEF和性腺基質(zhì)細(xì)胞/SCs等)一方面可以促進(jìn)PGCs的附著，另一方面可以分泌一些促生殖抑分化的細(xì)胞因子。維持PGCs體外存活的必需生長因子(干細(xì)胞生長因子/SCF、白血病抑制因子/LIF、堿性成纖維生長因子/bFGF和胰島素樣生長因子－1/IGF－1等)能夠增強(qiáng)PGCs的增殖并保持其發(fā)育全能性。

秦潔等［14］使用傳至第3代的CEF作為飼養(yǎng)層，可將經(jīng)冷凍保存的雞PGCs傳至6代。王娟等［15］研究表明MEF比STO更適宜作為飼養(yǎng)層來培養(yǎng)胚胎生殖細(xì)胞，能更好地維持PGCs的正常核型，使其連續(xù)增值。Hoyer等［16］研究表明SCF能夠維持細(xì)胞的存活和凋亡，并通過cAMP的調(diào)節(jié)對細(xì)胞的有絲分裂產(chǎn)生影響。Farini等［17］研究發(fā)現(xiàn)LIF是由體細(xì)胞產(chǎn)生的，能夠通過對體細(xì)胞的作用改變PGCs凋亡和增殖的狀態(tài)。謝蓓等可將雞PGCs傳至23代，且每代增殖近10倍，其使用堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、人胰島素樣生長因子(hIGF－1)、小鼠白血病抑制因子(mLIF)與5 d雞胚胎性腺基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)［18］。研究表明，在培養(yǎng)基中添加大量生長因子的同時，加入5 d雞胚性腺基質(zhì)細(xì)胞，為PGCs提供良好的微環(huán)境，促進(jìn)其增值。多種生長因子和基質(zhì)細(xì)胞的結(jié)合作用，改變了PGCs的發(fā)育程序，阻斷其向成熟生殖細(xì)胞分化，同時刺激其大量增殖［19］。因此，對飼養(yǎng)層細(xì)胞與生長因子的相互作用進(jìn)行研究也將對PGCs的體外培養(yǎng)做出貢獻(xiàn)。

3 PGCs的應(yīng)用

生產(chǎn)嵌合體、制備轉(zhuǎn)基因家禽、提高家禽生產(chǎn)性能及抗病能力，使得家禽PGCs細(xì)胞在生物制藥產(chǎn)業(yè)以及家禽相關(guān)研究中發(fā)揮不可估量的作用。另外，由于家禽不易獲得單細(xì)胞受精卵，家禽PGCs細(xì)胞在搶救和保護(hù)瀕危珍稀禽類遺傳資源方面，也將提供新的思路與方法［20］。

3.1 PGCs在禽類嵌合體制備上的應(yīng)用 已有研究表明，將長期的低溫冷凍保存的原始生殖細(xì)胞(PGCs)，解凍后移入受體胚胎可以產(chǎn)生可育的生殖嵌合體，將生殖嵌合體的禽類自交，可以產(chǎn)生珍稀的禽類資源。因此，應(yīng)用PGCs進(jìn)行禽類嵌合體的制備具有重要的生物學(xué)意義。Naito等通過分離不同毛色的雞的PGCs，制備了嵌合體，并且成功地從F1代中獲得了來自供體PGCs的后代［21］。Chang等通過移植不同品系鵪鶉的PGCs制備了嵌合體，獲得了來自供體PGCs的后代［22］。Yasuda等［23］和 Ohno等［24］在鵪鶉與雞之間移植血液中PGCs，鵪鶉PGCs可在雞性腺中生存。李贊東等成功制備了鴨雞種間嵌合體，其利用了胚盤細(xì)胞移植法并獲得了1只種系嵌合體［25］。劉春海等將分離的原始生殖細(xì)胞以微注射法轉(zhuǎn)移至14～15期麻鴨胚胎中制備了雞鴨種間嵌合體，獲得8只雛鴨(8/110)。以雞W特異DNA探針原位雜交法在早期鴨胚性腺中檢測到雞原始生殖細(xì)胞，嵌合率達(dá)84.2%(16/19)［26］。Bednarczyk等成功制備了綠腿鷓鴣－白來航雞的生殖嵌合體，其中供體為綠腿鷓鴣，受體為白來航雞，并將得到的雄雌生殖嵌合體雞互相交配產(chǎn)生了純合的轉(zhuǎn)基因綠腿鷓鴣后代［27］。迄今為止，禽類嵌合體制備的效率都很低。因此，制備嵌合體模型的條件對于恢復(fù)珍稀瀕危品種以及品種資源多樣性保護(hù)和利用起到至關(guān)重要的作用，對其條件的深入探索將是未來研究的重要方面。

3.2 PGCs在轉(zhuǎn)基因禽類的應(yīng)用 與哺乳動物不同，禽類胚胎中的PGCs經(jīng)過由血管向性腺遷移的過程，最終在性腺中轉(zhuǎn)變?yōu)榫雍吐炎?。目前，利用乳腺作為生物反?yīng)器生產(chǎn)珍貴醫(yī)用蛋白質(zhì)已有不少成功的報道，禽類與哺乳動物相比在該領(lǐng)域的研究發(fā)展相對滯后。轉(zhuǎn)基因雞可作為一種生物反應(yīng)器，生產(chǎn)具有重要價值的藥用蛋白。傳統(tǒng)的禽類轉(zhuǎn)基因研究擁有復(fù)雜的操作手法，包括精子載體轉(zhuǎn)基因法、反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)基因法、受精卵移植法、單細(xì)胞受精卵微注射法等。然而，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法在物種之間有明顯的局限性。利用原始生殖細(xì)胞(PGCs)嵌合體法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因禽類生產(chǎn)，與其他方法相比是卓有成效的，可從整體上減少時間、設(shè)備以及試劑的需求。這種方法使研究者在沒有大量PGCs培養(yǎng)設(shè)施存在或缺少實現(xiàn)廣泛生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞的條件的情況下，進(jìn)行簡單有效的轉(zhuǎn)基因雞生產(chǎn)。因此，在技術(shù)水平發(fā)展提高的基礎(chǔ)上，結(jié)合家雞個體小、世代間隔短、生產(chǎn)性能高、維持種群容易的特點(diǎn)，PGCs最適于轉(zhuǎn)基因家雞的研究，并且在地方雞種保護(hù)方面也具有重要的應(yīng)用價值。Chapman等利用慢病毒載體導(dǎo)入法將外源基因?qū)肱咛ズ螅G色熒光蛋白可以在全身廣泛表達(dá)［28］。

Van de Lavoir等研究發(fā)現(xiàn)禽類PGCs經(jīng)遺傳修飾后仍具有進(jìn)入生殖系的能力，并可在體外誘導(dǎo)分化為胚胎生殖細(xì)胞(Embryonic germ cells，EG細(xì)胞)，進(jìn)而產(chǎn)生所有的體組織，并通過電轉(zhuǎn)法利用PGCs獲得了體外高表達(dá)的轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白的后代［29］。Chojnacka－Puchta等［30］已通過控制禽類轉(zhuǎn)移到胚胎的PGCs產(chǎn)生生殖系嵌合體來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞。

4 存在問題及應(yīng)用前景

通過體外分離培養(yǎng)獲得大量可用PGCs，為制備嵌合體及轉(zhuǎn)基因雞的研究奠定了基礎(chǔ)。酶解離法與Ficoll密度梯度離心法被用作分離PGCs的常用方法。各種飼養(yǎng)層以及生長因子在PGCs體外培養(yǎng)體系中也屢見不鮮。在其分離培養(yǎng)中，酶處理時間過長以及絲裂霉素處理飼養(yǎng)層后其殘留物質(zhì)對PGCs的損傷等問題仍需要進(jìn)一步改善。原始生殖細(xì)胞具有特殊的發(fā)育分化過程，具有明顯的干細(xì)胞性質(zhì)，若將其成功培養(yǎng)成系，即建立胚胎多潛能干細(xì)胞系，將對干細(xì)胞研究做出巨大貢獻(xiàn)，為禽類胚胎發(fā)育及轉(zhuǎn)基因模型的建立等提供更好的平臺。

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