黃鱔受精卵致病菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

黃鱔受精卵致病菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)*

通訊作者：周秋白(1965—)，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與繁殖研究。

宋明張錦華劉金海周秋白

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045)

摘要：苗種供應(yīng)一直是黃鱔規(guī)?；B(yǎng)殖的制約因素，為提高黃鱔苗種培育成活率，本試驗(yàn)對黃鱔卵孵化過程中出現(xiàn)死卵和健康黃鱔卵及池水進(jìn)行病原的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)。以死亡的黃鱔卵與健康黃鱔卵及池水所含細(xì)菌為研究對象，對疑似病原菌進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、溶血和攻毒試驗(yàn)，然后進(jìn)行生化鑒定，采用藥物敏感試驗(yàn)測定病原菌分離株對多種抗生素的敏感性。結(jié)果表明：分離的5株菌為革蘭氏陰性短桿菌，在血平板上均有明顯β溶血環(huán)，其中有2株菌溶血環(huán)特別明顯；通過腹腔注射小白鼠和浸泡黃鱔的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)致病能力非常強(qiáng)，經(jīng)生化鑒定表明5株菌均為嗜水氣單胞菌。藥敏試驗(yàn)顯示5株菌均對慶大霉素表現(xiàn)高度敏感，對恩諾沙星和諾氟沙星等敏感，對阿莫西林不敏感。

關(guān)鍵詞：黃鱔受精卵; 嗜水氣單胞菌; 分離鑒定; 藥敏試驗(yàn)

收稿日期：2015-6-5

作者簡介：宋明(1991—)，男，湖北隨州人，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物疾病與防治。E-mail：songmingwell@163.com。

中圖分類號：S941、42

文章編號：1006-3188(2015)02-0037-06

黃鱔亦稱鱔魚，屬魚綱，合鰓目，合鰓科，黃鱔屬。營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美，深受消費(fèi)者喜愛，是我國重要的特種淡水經(jīng)濟(jì)魚類。隨著國內(nèi)外市場對黃鱔需求量的上升，捕撈強(qiáng)度加劇，加上環(huán)境的污染，黃鱔的野生資源量不斷下降,其產(chǎn)量已不能滿足市場的需求。為滿足日益增長的市場需求，人工繁養(yǎng)殖已是趨勢。因黃鱔具性逆轉(zhuǎn)、懷卵量低及吐泡沫營巢孵卵等特點(diǎn)，致使其人工繁殖較其他魚類困難。黃鱔出血病是生產(chǎn)過程中危害范圍最廣、造成損失最大的疾病。研究表明[1-2]嗜水氣單胞菌是引起黃鱔出血病的主要病原菌，由該致病菌引起的患病黃鱔主要病癥有出血病、腸炎。少數(shù)出血病為病毒引起。在近年來黃鱔人工繁殖過程中，發(fā)現(xiàn)有卵或苗成批死亡的現(xiàn)象，本試驗(yàn)主要針對黃鱔孵化過程中死亡胚胎進(jìn)行致病菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)，確定該致病菌并為防治該菌引起的疾病提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1樣品采集

選取黃鱔繁殖孵化試驗(yàn)中死亡和健康的受精卵及孵化水，進(jìn)行細(xì)菌的分離。

1.1.2培養(yǎng)基和試劑

脫纖維兔血培養(yǎng)基(1%蛋白胨、0.5%牛肉膏、0.5%Nacl、2%瓊脂粉、5%的新鮮兔血)，普通瓊脂培養(yǎng)基，普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，均按照常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)[3]配置而成。藥敏試紙和微量生化鑒定管購自杭州天和生物試劑公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病原菌的分離與純化

在無菌操作臺(tái)，卵表面消毒后，用無菌鑷子撕破卵膜，將胚胎液涂布于普通瓊脂平板上，同時(shí)將有死亡黃鱔的池水和健康黃鱔池水各1ml分別涂于瓊脂平板上。在30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h后觀察，然后挑取疑似菌落在普通培養(yǎng)基上多次純化，得到7株大小、形態(tài)相似的菌落。分別命名為D-1、D-2、D-3、D-4、D-5(均來源于死亡胚)、H-1(來源于健康的胚)、7-1(來源于池水，死亡與健康胚的池水中均有，但死亡胚的池水中此類菌落數(shù)量明顯多于健康胚所在的池水)，挑取典型的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，觀察形態(tài)并記錄結(jié)果。

1.2.2溶血試驗(yàn)

分別把七種菌劃線或點(diǎn)種接種在已經(jīng)配置好的脫纖維兔血培養(yǎng)基(5%兔血)平板上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，然后觀察接種的菌落周圍有無溶血現(xiàn)象及溶血圈的大小。

1.2.3小白鼠感染試驗(yàn)

將小白鼠分為五組(5只∕組)，另將具有溶血特性的四株菌D-3，D-5，H-1，7-1培養(yǎng)成菌液(濃度為1.5×108cfu/ml)，每只小白鼠注射0.2ml；對照組注射0.2ml生理鹽水，觀察[4]。

1.2.4黃鱔浸泡試驗(yàn)

依據(jù)1.2.3試驗(yàn)結(jié)果，挑選了2株對小白鼠致病力強(qiáng)的菌做浸泡健康黃鱔的實(shí)驗(yàn)。把D-3、7-1分為兩組對黃鱔進(jìn)行浸泡感染試驗(yàn)，在普通的桶中裝50cm深的水，每個(gè)桶放有30條100g/條的黃鱔，并加入20ml的菌液(濃度同上)，在22℃左右的溫室中培養(yǎng)觀察[2]。

1.2.5細(xì)菌鑒定

用已經(jīng)純化好的5株菌D-3,D-4,D-5,H-1,7-1分別接種至到各種微量生化發(fā)酵管中，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，觀察顏色變化并記錄結(jié)果。

1.2.6藥敏試驗(yàn)

將5株菌(同上)的肉湯培養(yǎng)物用無菌棉簽蘸取菌液(濃度同上)均勻的涂在普通瓊脂培養(yǎng)基平板上，待菌液吸收后，用無菌鑷子輕按藥敏片，確保貼穩(wěn)。藥敏片與培養(yǎng)基完全接觸。放入生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)18～24h。參照藥敏紙片法的抑菌圈直徑和敏感標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析[5]。

2　致病菌的鑒定結(jié)果

2.1病原菌的鑒定

2.1.1細(xì)菌形態(tài)

觀察普通培養(yǎng)皿上分離純化的菌落形態(tài)，菌落圓形，邊緣整齊、光滑，有乳白色和淡黃色2種。進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，發(fā)現(xiàn)均為革蘭氏陰性短桿菌 ，多為單個(gè)分散排列或2個(gè)連成短鏈(圖1-a)。

圖 1　部分病原菌形態(tài)及β溶血

2.1.2溶血試驗(yàn)

在5%兔血平板上培養(yǎng)的七株菌有五株出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，分別為D-3、D-4、D-5、H-1、7-1，菌落周圍呈透明狀溶血環(huán)，其中H-1和D-3的溶血現(xiàn)象最明顯較其它3株大(如圖1-b所示)，而D-1、D-2則沒有出現(xiàn)明顯溶血現(xiàn)象。

2.1.3細(xì)菌鑒定結(jié)果

將純化的細(xì)菌在無菌條件(無菌操作臺(tái))下接種到微量生化管中，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，生化鑒定結(jié)果符合《魚類及其他水生動(dòng)物細(xì)菌實(shí)用鑒定指南》[6]中對嗜水氣單胞菌的描述(見表-1)，可初步鑒定為嗜水氣單胞菌。從表格可以看出這五種菌的這些生化反應(yīng)指標(biāo)是一致的，從實(shí)驗(yàn)過程來看各菌間的顏色有些差異。

表 1　菌株的生化特性

注:“+”表示陽性，“-”表示陰性

2.2動(dòng)物致病試驗(yàn)

2.2.1小白鼠感染試驗(yàn)結(jié)果

從菌落形態(tài)觀察和革蘭氏染色，以及溶血試驗(yàn)結(jié)果來看，D-4和D-5非常的相似，所以本試驗(yàn)設(shè)置了五組，D-3、D-5、H-1、7-1和空白對照組，對每只小白鼠進(jìn)行腹腔注射0.2ml菌液(濃度為1.5×108cfu/ml)，經(jīng)過10h觀察，試驗(yàn)組全部死亡，對照組都無異常。解剖各實(shí)驗(yàn)組的死亡小白鼠發(fā)現(xiàn)7-1小白鼠的肝臟較其它組的出現(xiàn)明顯的病理變化，肝臟變?yōu)榛液稚?，體內(nèi)液體多，內(nèi)臟腫大，出血癥狀。進(jìn)行肝臟分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)與7-1吻合，證明這些菌對動(dòng)物的有較強(qiáng)的致病力。

2.2.2黃鱔浸染試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過3d培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)D-3組的黃鱔表皮出現(xiàn)多處潰爛，是出血病典型的癥狀，取肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)得到了致病菌，7-1組黃鱔沒有異常的變化，結(jié)果表明7-1對黃鱔的致病力比D-3弱很多。

2.3藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)的藥片有九種(見表 2)。靜置培養(yǎng)24h后,觀察抑菌圈大小，并測量直徑，結(jié)果見表2。發(fā)現(xiàn)各菌株對不同抗生素藥物的敏感性存在一定的差異性。4株菌對慶大霉素高度敏感，5株菌對多種抗生素均呈現(xiàn)中度敏感，對桿菌肽、甲氧嘧啶、阿莫西林不敏感。

表 2　菌株對抗生素的敏感試驗(yàn)結(jié)果

注:“+++”表示高度敏感(20mm≤d)；“++”表示中度敏感(15mm≤d≤19mm)“+”表示低度敏感(10mm≤d≤14mm)； “-”表示不敏感(d≤9mm)。

3　討論

本試驗(yàn)對黃鱔苗種的致病菌進(jìn)行了分離鑒定與藥敏試驗(yàn)，經(jīng)過一系列的生化鑒定試驗(yàn)確定了引起苗種死亡的主要是嗜水氣單胞菌。目前對嗜水氣單胞菌的研究較多，如甲魚穿孔病，草魚腸炎、出血病，黃鱔的腸炎、出血癥，異育銀鯽的敗血癥等均進(jìn)行過研究，但黃鱔卵和剛出膜的苗感染嗜水氣單胞菌沒有報(bào)道，可能是因?yàn)槿斯S鱔繁殖沒有廣泛開展，更多的是在研究如何人工孵化的水質(zhì)調(diào)控等技術(shù)方面的問題。嗜水氣單胞菌在自然界中廣泛分布，普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中，有致病性菌株和非致病性菌株兩種。致病性菌株可感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類等。實(shí)際病例中以急性出血性敗血癥為主要特征；慢性感染則主要表現(xiàn)為皮膚潰瘍或腸炎。嗜水氣單胞菌可以產(chǎn)生毒性很強(qiáng)的外毒素，如：溶血素、組織毒素、壞死毒素、腸毒素和蛋白酶等，當(dāng)環(huán)境突變，水質(zhì)惡化，魚體抵抗力下降時(shí)，最容易出現(xiàn)爆發(fā)性出血病而由嗜水氣單胞菌感染的疾病一般病勢較猛，多為惡性，死亡率很高，對水產(chǎn)養(yǎng)殖的危害相當(dāng)大，造成的經(jīng)濟(jì)損失非常多。在黃鱔育苗生產(chǎn)中應(yīng)引起重視。

嗜水氣單胞菌是一類復(fù)雜，獨(dú)特的水生細(xì)菌群體，這個(gè)細(xì)菌群體有一定的共性，就如生化鑒定，菌落觀察幾乎都是一樣的，但菌株間也有一定的差異，本試驗(yàn)在死亡胚和健康胚及池水中均能分離到溶血的嗜水氣單胞菌，且這些菌對小鼠和黃鱔的致病性有差別。在小白鼠試驗(yàn)當(dāng)中7-1組表現(xiàn)出較強(qiáng)致病性，而在大黃鱔浸染試驗(yàn)中就不如D-3。而本實(shí)驗(yàn)H-1是分離自健康苗種，溶血現(xiàn)象也非常明顯，腹腔注射小鼠后能引起小鼠死亡，但沒有引起黃鱔苗種死亡。從此推測菌株的致病與宿主及環(huán)境有密切的關(guān)系；嗜水氣單胞菌是一種條件致病菌[7]，其同樣存在健康苗種的水體中而未引起致病是值得研究的問題。本試驗(yàn)結(jié)果初步表明，該菌在健康苗種水體中的數(shù)量少于發(fā)病菌種水體，推測可能健康苗種水體中可能存在其它有益微生物抑制了嗜水氣單胞菌的增長，具體有待于進(jìn)一步的研究。

所分離的5株菌對抗生素敏感性也存在一定的差異性，這可能與菌株所生活的環(huán)境因素有一定的關(guān)系。王英光等[8]在對黃鱔腸炎細(xì)菌的分離與藥物篩選的研究中得到的嗜水氣單胞菌菌株對諾氟沙星、慶大霉素、卡那霉素等高度敏感，對青霉素、乙酰螺旋毒素、新生霉素、安芐青霉素、磺胺甲基異噁唑不敏感。鄧國成等[9]分離的嗜水氣單胞菌對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星等高度敏感，對慶大霉素等敏感，對阿莫西林、桿菌肽、羧芐青霉素等不敏感。本試驗(yàn)得出的結(jié)果與之研究結(jié)果相似，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明該致病菌對慶大霉素高度敏感，對呋喃唑酮、恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢氨芐敏感，對桿肽菌、甲氧嘧啶(TMP)、阿莫西林不敏感。該菌感染的主體是黃鱔卵，與一些患病魚類具體表現(xiàn)出的癥狀及致病菌的研究數(shù)據(jù)對比存在一些差異，而且由于地域用藥的特點(diǎn)不同，嗜水氣單胞菌對一些抗菌藥物耐藥性也有一些差異，我們在生產(chǎn)過程中要根據(jù)當(dāng)?shù)氐募?xì)菌耐藥性情況進(jìn)行合理的選擇和使用。

臨床上預(yù)防細(xì)菌所引起的水生動(dòng)物疾病通常依賴于抗菌藥物，使得菌株耐藥性日益增加，給治療帶來很大的困難，也影響水產(chǎn)品的質(zhì)量。楊麗莉等[10]通過對枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的研究，發(fā)現(xiàn)其對嗜水氣單胞菌有很好的抑菌效果。李卓佳等[11]應(yīng)用芽孢桿菌調(diào)控蝦池，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌可以抑制條件致病菌的繁殖，促進(jìn)物質(zhì)和能量循環(huán)，有利于水體凈化。從本試驗(yàn)后續(xù)結(jié)果看，對于嗜水氣單胞菌這類條件性致病菌所引起的黃鱔苗種疾病的預(yù)防，可能通過調(diào)節(jié)水體中微生態(tài)環(huán)境是有效的途徑。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳懷青，陸承平.嗜水氣單胞菌:黃鱔出血性敗血癥的病原[J].中國人獸共患病雜志，1991，7(4)：21-23.

[2] 彭彬，楊光友，陳曉利，等. 黃鱔出血病病原菌的分離與鑒定[J].淡水漁業(yè)，2011，41 (3)：72-76.

[3] 姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].2版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002：19-22.

[4] 凌紅麗，陸承平，陳懷青，馬向東.6株嗜水氣單胞菌的毒力因子及其對小鼠的致病性[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，19(3)：255-257.

[5] 宋鐵英，陳強(qiáng)，鄭在予，等.不同來源嗜水氣單胞菌的抗菌素耐藥性及耐藥機(jī)制分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23(2)：119-124.

[6] 布勒.魚類及其他水生動(dòng)物細(xì)菌實(shí)用鑒定指南[M].北京：海洋出版社，2013：43-45.

[7] AUSTIN B,AUSTIND A.Bacterial Fish Pathogens:Disease in Farmed and Wild Fish[M].New York:John Wiley and Sons, 1987:364.

[8] 王英光，周海龍，王長興. 黃鱔腸炎細(xì)菌分離及藥物篩選[J]. 河北漁業(yè)，2013(5)：34-36.

[9] 鄧國成，江小燕，葉星，等.草魚出血病混合感染的嗜水氣單胞菌的分離、鑒定與理化特性[J].微生物學(xué)通報(bào)，2009，36(8)：1170-1177.

[10] 楊麗莉，呂鳳霞，別小妹，等.枯草芽孢桿菌抗菌脂肽對嗜水氣單胞菌抑菌效果[J].食品科學(xué)，2011，32(1)：193-198.

[11] 李卓佳，郭志勛，馮娟，等.應(yīng)用芽孢桿菌調(diào)控蝦池微生態(tài)的初步研究[J].海洋科學(xué)，2006，30(11)：28-31.