乳品中3種常見細菌多重PCR檢測方法的建立*

閆晗，呂國欽，張洋，張笑嫣，馮旭，王麗威

1(遼寧工程技術大學理學院，遼寧 阜新，123000)2(本溪市食品藥品檢驗所，遼寧本溪，117000)

沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是乳與乳制品中的常見致病菌［1］，大腸桿菌是條件致病菌，廣泛存在于自然界中，常被作為衛(wèi)生監(jiān)督的指示菌［2］。傳統(tǒng)的微生物檢測和鑒定方法依賴于分離培養(yǎng)、生化試驗和血清學鑒定，具有培養(yǎng)時間長和操作繁瑣等缺陷。目前，一些快速檢測技術被應用于乳制品的微生物檢驗中，如利用流式細胞計數法檢測乳品中的細菌總數［3］、應用酶聯(lián)免疫吸附法檢測是否存在某種微生物［4］、以及與PCR技術相結合的免疫磁珠吸附與熒光定量PCR聯(lián)合技術和環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測乳品中的致病菌［5-7］。雖然這些快速檢測法具有敏感、快速和簡單的優(yōu)點，卻存在每次只能檢測一種病原菌的弊端。多重PCR(Multiplex PCR)是在同一個反應體系中加入多對引物，能夠同時擴增出多個目的片段，具有高效性、系統(tǒng)性和經濟簡便的特點，常用于成組病原體的檢測。

本研究以大腸桿菌phoA基因、金黃色葡萄球菌nucA基因和沙門氏菌invA基因為靶基因，建立同時檢測乳品中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的多重PCR檢測方法。為乳品中微生物檢測提供一種快速準確、高效經濟的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

供試菌株，大腸桿菌(CICC 10003)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)和腸炎沙門氏菌(ATCC 13076)均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。痢疾志賀氏菌、普通變形桿菌、蠟樣芽胞桿菌、白色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌，均由中國科學院沈陽生態(tài)研究所惠贈。所有菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h，轉接3次后備用。

生牛乳、巴氏乳、滅菌乳、煉乳和奶粉均購自當地超市。新鮮乳品經無菌操作分裝于凍存管，于-20℃冰箱中保存。

1.1.2 試劑與儀器

TaKaRa ExTaq、10 ×PCR buffer、dNTP 混合物、MgCl2和DL2000 DNA Marker，大連寶生物公司;PCR引物由大連寶生物公司合成;瓊脂糖(Sigma)、溶菌酶、蛋白酶K和Tris-飽和酚，沈陽聯(lián)星公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、氯仿、異戊醇、十二烷基磺酸鈉(SDS)、無水乙醇、醋酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

梯度PCR儀，TECHNE-512(英國);凝膠成像系統(tǒng)為2020D，北京炳洋。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體DNA的提取

①取1 mL培養(yǎng)物于1.5 mL離心管中，室溫8 000 r/min離心5 min，棄上清液。重復1次。向離心管中加入0.5 mL TE(10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH8.0)用于懸浮菌體。② 加入6 μL 50 mg/mL溶菌酶，37℃水浴30 min～1 h。再加入10%SDS 25 μL 和20 mg/mL 蛋白酶 K 3 μL，50 ℃水浴 3 h。③12 000 r/min離心10 min，取上清液轉入新的1.5 mL離心管中，加入等體積的Tris-飽和酚抽提10 min。④12 000 r/min離心10 min，用闊口Tip頭吸上清液于新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)抽提10 min。⑤ 12 000 r/min 離心10 min，取上清液于新離心管中。加入2倍體積的冷無水乙醇和1/5體積醋酸鈉，混勻，沉淀DNA。⑥ 用75%乙醇洗滌DNA 3次，室溫干燥，TE溶解。置4℃待用。

1.2.2 PCR引物

以大腸桿菌的phoA基因為靶序列，引物序列參照許一平的文獻報道［8］。以金黃色葡萄球菌的nucA基因，引物序列參照楊洋的文獻報道［9］;沙門氏菌的invA基因作為靶基因，引物序列參照楊平的文獻報道［10］。具體引物序列的組成見表1。

表1 靶基因與引物序列Table 1 Target gene and primer sequences

1.2.3 單重PCR條件優(yōu)化

分別對3種標準菌進行PCR擴增，以確定最佳的退火溫度。PCR反應體系中各成分的濃度為:Mg2+1.5 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、上下游引物各0.5 μmol/L、模板15 ng以及 Ex Taq 1 U。根據各引物的理論Tm值，設定PCR反應的退火溫度梯度。擴增程序為:94℃預變性5 min后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性45 s，退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)結束后72℃延伸7 min。PCR反應的產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 引物特異性的驗證

將3株標準菌分別與其對應的引物對進行單重PCR擴增，以評價和驗證各引物對的擴增特異性。各引物對的退火溫度為1.2.3中經過優(yōu)化確定的溫度。

1.2.5 多重PCR條件優(yōu)化

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的混合DNA為模板，以等量添加不同菌體的引物對為原則，優(yōu)化多重PCR的反應條件。初始反應體系為:Mg2+1.5 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、3 對引物各 0.5 μmol/L、3個菌體的模板各15 ng以及Ex Taq 1 U。對多重PCR的退火溫度、dNTP濃度、Mg2+濃度、引物濃度和Ex Taq酶量進行優(yōu)化。

1.2.6 多重PCR特異性驗證

為進一步驗證本試驗優(yōu)化的多重PCR的特異性，分別以3種標準株和其他菌株的DNA為模板，同時加入3對引物，用優(yōu)化后的多重PCR反應條件進行PCR擴增。

1.2.7 樣品檢測

選取生鮮乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳、煉乳和乳粉作為檢測樣本，利用國標方法，檢測樣本中是否存在3種致病菌。大腸桿菌計數的檢測方法參照GB 4789.38-2012;沙門氏菌的檢測方法參照 GB 4789.4-2010;金黃色葡萄球菌的檢測方法參照GB 4789.10-2010。

對國標法檢測3種菌均為陰性的乳品樣本進行人工模擬污染。將3種菌懸液分別以10倍稀釋法進行梯度稀釋，使含菌量＞104CFU/mL，按任意1種、2種、3種菌懸液等量混合接種于5 g乳品樣品中，于45 mL LB培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)8 h，提取DNA，用優(yōu)化后的體系進行PCR檢測，以未進行人工污染的樣品作為對照，以驗證多重PCR檢測方法的可行性。

2 結果與分析

2.1 各引物對最佳退火溫度的確定

大腸桿菌單重PCR反應退火溫度電泳圖見圖1-(a)。圖中的1～7所代表的退火溫度分別為46、48、50、52、54、56、58 ℃。金黃色葡萄球菌單重 PCR 反應退火溫度電泳圖見圖1-(b)。圖中的1～7所代表的退火溫度分別為 46、48、50、52、54、56、58 ℃。沙門氏菌單重PCR反應退火溫度電泳圖見圖1-(c)。圖中的1～7 所代表的退火溫度分別為46、48、50、52、54、56、58 ℃。

由圖1-(a)可知，1～7號泳道出現(xiàn)條帶且條帶出現(xiàn)在Marker DL2000 500～750bp之間，符合預擴增片段622 bp長度的特性，可以確定為目的片段。3、4、5號泳道條帶較亮，其中4號泳道的條帶亮度最強，因此選擇4號泳道的退火溫度為大腸桿菌phoA基因單重PCR反應的最佳退火溫度，即52℃。

圖1 退火溫度梯度電泳圖(M:Marker DL2000)Fig.1 Electropherogram of annealing temperature gradient

由圖1-(b)可知，1～7號泳道出現(xiàn)條帶且條帶出現(xiàn)在Marker DL2000 250 bp附近，符合預擴增片段270 bp長度的特性，可以確定為目的片段。其中4號最亮，因此，金黃色葡萄球菌nucA基因單重PCR反應的最佳退火溫度為52℃。

由圖1-(c)可知，1～7號泳道出現(xiàn)條帶且條帶出現(xiàn)在Marker DL2000 500 bp附近，符合預擴增片段495 bp長度的特性，可以確定為目的片段。其中5號最亮，因此選擇5號泳道的退火溫度為沙門氏菌invA基因單重PCR反應的最佳退火溫度，即54℃。

文獻中，擴增phoA、nucA和invA基因的退火溫度分別為55、52和54℃［8-10］。本文所確定的各引物對最佳退火溫度與文獻記載略有不同，這可能是由于不同實驗室之間儀器設備的差異造成的。

2.2 引物特異性驗證結果

單重PCR引物特異性驗證的電泳結果如圖2所示。圖中1～9號所表示的標準菌和PCR擴增用的引物對組合見表2。

表2 引物對照表Table 2 primer

圖2 引物特異性電泳圖(M:Marker DL2000)Fig.2 Electropherogram of detecting primers specificity

由圖2可知，只有1、4、7號泳道有條帶，且符合目的片段的長度。擴增phoA基因的引物對(F1、R1)在沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的DNA中無匹配的靶基因(5號和9號泳道)，說明擴增phoA基因的引物對具有良好的特異性。2號和6號泳道無條帶，3號和8號泳道無條帶分別說明擴增nucA基因的引物對(F2、R2)和擴增invA基因的引物對(F3、R3)均具有很好的特異性。引物間無交叉反應，可以選擇該3對引物作為多重PCR的引物組。

2.3 多重PCR條件的確定

2.3.1 退火溫度的確定

依據單重PCR反應確定的退火溫度，將多重PCR反應的退火溫度梯度設置為46、48、50、52和54℃(分別由1～5號表示)，電泳結果如圖3-(a)所示。由圖可知，4號泳道中的3個條帶亮度最強，與Marker DL2000比對，3個條帶均為目的片段，無非特異性條帶擴增。因此，確定52℃為多重PCR反應的最佳退火溫度。dNTP濃度、Mg2+濃度、引物濃度和Ex Taq酶量的優(yōu)化實驗均在52℃退火溫度下進行。

2.3.2 dNTP濃度的確定

將多重PCR反應的dNTP濃度梯度設置為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mmol/L(分別由1～7號表示)，電泳結果如圖3-(b)所示。圖中7個泳道均有PCR產物出現(xiàn)，隨著dNTP濃度的增加，條帶的亮度會減弱，這是由于dNTP濃度提高后會降低Mg2+的濃度，導致降低了整個反應體系的效率。圖中的7號泳道由于dNTP濃度過大對PCR反應產生了抑制作用，僅擴增出2條目的條帶。5號泳道中的3條目的條帶亮度最強，因此選擇5號泳道的dNTP濃度為最佳，即dNTP濃度為0.30 mmol/L。

2.3.3 Mg2+濃度的確定

將多重PCR反應的Mg2+濃度梯度設置為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mmol/L(分別由1～7 號表示)，電泳結果如圖3-(c)所示。Mg2+濃度過低會降低Taq酶的活性，其濃度過高會引起非特異性擴增。有圖可知，當Mg2+濃度為2.5 mmol/L時，可得到穩(wěn)定、清晰的條帶，因此選擇 4號泳道的2.5 mmol/L為最佳Mg2+濃度。

2.3.4 引物濃度的確定

由Mg2+濃度優(yōu)化的電泳圖可知(見圖3-(c))，雖然3對引物是等量添加的，但是3個條帶的亮度卻不一致。根據各條帶的亮度對各引物對的濃度進行了調整，各引物對的添加量見表3，其電泳結果如圖3-(d)所示。

表3 引物對添加量Table 3 primer concentration

引物濃度應該與模板量相適應，引物濃度高易與模板發(fā)生錯配，當模板量適中而引物濃度過高時，PCR反應會受到抑制。圖中7個泳道均有PCR產物出現(xiàn)，1號、7號泳道由于引物濃度不適合，條帶亮度較弱，4號泳道中的3條目的條帶亮度最強，但是卻在250～500bp間有非特異性條帶，因此選擇3號泳道的引物濃度為最佳，即 PF1、PR1各 0.50 μmol/L、PF2、PR2各 0.75 μmol/L、PF1、PR1各 0.75 μmol/L。

圖3 多重PCR條件優(yōu)化結果(M:Marker DL2000)Fig.3 Results of optimizing the multiplex PCR conditions

2.3.4 Ex Taq酶量的確定

將多重PCR反應的Ex Taq酶添加量梯度設置為0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5U(分別由1～7 號表示)，電泳結果如圖3-(e)所示。圖中7個泳道均有PCR產物出現(xiàn)，1號、7號泳道由于Ex Taq酶量不適合，僅能出現(xiàn)2條條帶，4號泳道中的3條目的條帶亮度最強，因此選擇4號泳道的Ex Taq酶酶量為最佳的酶添加量，即Ex Taq酶酶添加量為1.5U。

優(yōu)化的多重PCR反應條件為，退火溫度52℃、dNTP濃度為0.30 mmol/L、Mg2+濃度為2.5 mmol/L、擴增phoA基因的引物對濃度為0.50 μmol/L、擴增nucA基因和invA基因的引物對濃度均為0.75 μmol/L、DNA 15 ng、Ex Taq酶量為1.5 U。

2.4 多重PCR特異性驗證結果

用優(yōu)化好的多重PCR反應體系擴增各供試菌株的DNA，以檢測多重PCR的特異性(圖4)。由圖4可知，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均出現(xiàn)特異性條帶，其余非目的菌均為擴增出條帶。說明選用的3對引物特異性強，優(yōu)化的多重PCR體系可用于檢測大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。

圖4 多重PCR特異性Fig.4 Specificity of the multiplex PCR

2.5 樣品檢測

2.5.1 國標法檢測

依據國標法對生鮮乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳、煉乳和乳粉樣品進行檢測，其中鮮乳可檢出大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，巴氏殺菌乳可檢出大腸桿菌，其他3種乳品沒有檢出3種致病菌。

2.5.2 多重PCR法檢測

乳品樣本在LB培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)8 h后，采用1.2.1的方法提取微生物的DNA，利用優(yōu)化后的多重PCR體系檢測是否存在3種致病菌，電泳結果見圖5。

圖5 樣品的多重PCR檢測結果(M:Marker DL2000)Fig.5 Result of detection dairy samples by multiplex PCR

圖5中1～5號泳道的樣品分別為鮮乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳、煉乳和乳粉。其中1號泳道出現(xiàn)在3條條帶，分別位于Marker 500 bp和750 bp之間、250 bp附近、500 bp附近，說明鮮乳中有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌污染;2號泳道在Marker 500 bp和750 bp之間出現(xiàn)條帶，說明巴氏殺菌乳有大腸桿菌污染;而3、4、5號泳道沒有條帶出現(xiàn)，說明用優(yōu)化后的多重PCR體系未從滅菌乳、煉乳和乳粉檢出致病菌。多重PCR的檢測結果與國標法檢測結果一樣，與國標法相比，多重PCR法具有操作簡便、節(jié)省時間的優(yōu)點;與單重PCR相比，多重PCR法具有節(jié)省成本的特點。

2.5.3 人工模擬污染樣品檢測

人工模擬污染滅菌乳、煉乳和乳粉。試驗證明人工污染的乳品樣品都能準確地檢測出所接種的細菌，并且無非特異性擴增，說明優(yōu)化后的多重PCR檢測方法對乳品中的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌有很好的特異性。

3 結論與討論

近年來，多重PCR常被用于檢測食品中的致病微生物，如檢測水產品中的沙門菌、副溶血性弧菌等致病菌［11-12］。與單重PCR相比，多重PCR具有效率高、節(jié)省成本的優(yōu)點，然而多重PCR的試驗設計卻比單重PCR更加復雜。在進行多重PCR時，引物對的選擇是最關鍵的，要確保引物自身沒有二級結構、引物之間不會發(fā)生相互作用、所有引物對的Tm值要相近、選擇的引物對在不同DNA模板間具有良好的擴增特異性等。

phoA基因是大腸桿菌的持家基因，可以作為PCR擴增的靶基因［9］;耐熱核酸酶編碼基因nuc基因是金黃色葡萄球菌所特有的，可將該基因作為擴增的靶基因［13］。沙門菌屬侵襲性抗原保守基因invA基因常被用于沙門菌 PCR檢測中［14］。劉繼超等［15］建立了可以快速檢測原料乳中沙門菌、無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR方法。郭清泉等［16］利用熒光雙重PCR技術建立了快速從乳品中檢測致病大腸桿菌的方法。許一平等［9］建立了敏感、特異、快速地檢測沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測方法，但并未通過檢測食品樣品來鑒定多重PCR方法的可行性。

多重PCR的擴增靈敏度較單重PCR低［17］，這是由于多重PCR中的多對引物之間會出現(xiàn)相互抑制的現(xiàn)象。在優(yōu)化多重PCR反應體系之初，多個引物對以等量添加是首要條件，如果出現(xiàn)目的條帶的亮度較單重PCR弱的情況，那么就必須對引物對的濃度進行優(yōu)化。本研究對多重PCR引物濃度的優(yōu)化結果就證明了這一點。在多重PCR中，擴增大腸桿菌phoA基因的引物對具有較強的擴增效率，條帶亮度最強，而擴增金黃色葡萄球菌nucA基因和沙門氏菌invA基因引物對的擴增效率均受到了抑制。王娜等［18］提出，減少擴增效率高的引物濃度比增加擴增效率低的引物濃度更有效。本研究中，提高擴增nucA基因和invA基因引物對的濃度，使3個目的片段均得到了有效的擴增。

本研究通過多重PCR反應體系的優(yōu)化，實現(xiàn)了乳品中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的同時檢測，多重PCR法較國標中常規(guī)的細菌學鑒定方法縮短了12～24 h，更加省時、省力。建立的多重PCR檢測方法更適合于批量樣品的檢測，具有重要的實際應用價值。

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