中心組合設(shè)計優(yōu)化嗜酸乳桿菌NCU402增菌培養(yǎng)基*

熊濤，王昕悅，楊正楠，姜亞茹，黎洪葉

(南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌，330047)

嗜酸乳桿菌作為胃腸道系統(tǒng)中重要的微生物種類之一，當其活菌數(shù)量大于106CFU/mL時，能有效地平衡人體消化道中有益、中性和有害微生物之間的平衡，有很好的益生功能［1-4］。乳酸菌菌劑制備的關(guān)鍵在于其高密度培養(yǎng)，而增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化是高密度培養(yǎng)的基礎(chǔ)［5-6］。嗜酸乳桿菌的營養(yǎng)要求復(fù)雜，需要氨基酸、核苷酸、單糖或寡糖、維生素等多種物質(zhì)［7-8］，并且營養(yǎng)物質(zhì)濃度要恰當合理［9］。響應(yīng)面法是通過擬合因素和響應(yīng)值的多元二次回歸方程，能精確分析各因子與響應(yīng)值的關(guān)系，尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，具有次數(shù)少、周期短、精度高等優(yōu)點［10-11］。較為常用的響應(yīng)面分析設(shè)計方法有中心組合設(shè)計和Box-behnken設(shè)計(BBD)，相比BBD而言，CCD具有旋轉(zhuǎn)性，可考慮因素交互作用，能預(yù)估曲率等優(yōu)點［12-13］。

本研究通過二水平部分因子設(shè)計和中心組合設(shè)計等方法，以期獲得LaNCU402高密度發(fā)酵液，為后期真空冷凍干燥菌劑制備和相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus NCU402)(以下簡稱LaNCU402):由南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室保藏提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基［14］:蛋白胨10.0 g、牛肉膏8.0 g、酵母粉 4.0 g、葡萄糖 20.0 g、吐溫 80 1.0 mL、K2HPO4·7H2O 2.0 g、NaAc·3H2O 5.0 g、檸檬酸三銨 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g，將上述成分加入到1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值為6.2，121℃高壓滅菌20 min;此培養(yǎng)基用于菌種活化、復(fù)壯。

MRS固體培養(yǎng)基:在MRS液體培養(yǎng)基成分中再加入1.5%～2.0%瓊脂粉，煮沸混勻調(diào)節(jié)pH后于121℃滅菌20 min;此培養(yǎng)基用于活菌計數(shù)。

酵母浸出液培養(yǎng)基:酵母抽提物5.0 g，葡萄糖15.0 g，將上述成分加入到1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，121℃滅菌20 min。

增菌培養(yǎng)基:按試驗設(shè)計添加各培養(yǎng)基成分，煮沸混勻后調(diào)整pH值為6.2，121℃滅菌20 min。

1.1.3 生長因子的制備

番茄汁的制備:將新鮮成熟番茄清洗干凈后去蒂去皮，切塊放入榨汁機中榨汁，用紗布過濾2次，取上清液待用。

胡蘿卜汁的制備:將新鮮胡蘿卜挑選清洗后去皮切片榨汁，用紗布過濾2次，取上清液待用。

平菇汁的制備:將鮮菇清洗后切碎，加入一定量蒸餾水榨汁，紗布過濾2次，取上清液待用。

黃豆芽汁的制備:將新鮮黃豆芽洗凈后榨汁，紗布過濾2次，取上清液待用。

黃瓜汁的制備:將新鮮黃瓜清洗后削皮切塊后榨汁，紗布過濾2次，取上清液待用。

啤酒:11°P青島啤酒。

1.1.4 主要試劑

脫鹽乳清粉D90(食品級、美國Davisco國際食品公司);葡萄糖分析標準品、乳酸分析標準品(美國Sigma公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.5 儀器及設(shè)備

PB203-N型分析天平，梅特勒-托利多國際股份有限公司;MJ-BL25C3型攪拌機，美的集團股份有限公司;C21-SK2105型多功能電磁爐，美的集團股份有限公司;雷磁PHS-25型數(shù)顯pH測定儀，上海精密科學儀器有限公司;DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司;YXQ-LS50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;BHC-1300ⅡA/B3型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;ZSD-A1160A生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司;Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司;Aminex-87H色譜柱，伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

取凍存LaNCU402甘油管，室溫靜置5 min后接于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)20 h后傳代復(fù)壯1～2次，備用。

1.2.2 增菌培養(yǎng)

將活化后的LaNCU402以4%(v/v)的接種量接入各增菌培養(yǎng)基，于37℃靜置培養(yǎng)20 h后，測定活菌濃度。

1.2.3 活菌濃度測定

采用MRS平板菌落計數(shù)法(GB/T 4789.35-2010食品衛(wèi)生微生物學檢驗食品中乳酸菌檢驗)。

1.2.4 發(fā)酵液中葡萄糖和乳酸的測定［15］

將發(fā)酵液在12 000 r/min下離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，得到的濾液用于高效液相色譜分析。色譜條件:進樣量20 μL，流動相為6 mmol/L H2SO4溶液，流速為 0.5 mL/min，柱溫 45℃，紫外檢測器檢測波長205 nm。選用示差折光檢測器檢測葡萄糖，紫外檢測器檢測乳酸。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 增菌培養(yǎng)基單因素試驗設(shè)計

1.3.1.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇

以酵母浸出液培養(yǎng)基、乳清粉培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行增菌培養(yǎng)20 h，每隔4 h進行活菌計數(shù)，確定適合LaNCU402生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.3.1.2 生長因子優(yōu)化

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同含量的生長因子:番茄汁、黃瓜汁、平菇汁、黃豆芽汁、胡蘿卜汁、脫脂乳、11°P啤酒添加量為10%(v/v)，菊糖、低聚果糖、脫鹽乳清粉D90、乳糖、大豆蛋白胨、半胱氨酸、水解酪蛋白添加量為10 g/L，VC和VB1添加量為0.2 g/L;增菌培養(yǎng)后確定LaNCU402的最優(yōu)生長因子。

1.3.2 二水平部分因子設(shè)計

在前期單因素試驗基礎(chǔ)上，選取葡萄糖(A)、蛋白胨(B)、牛肉膏(C)、酵母粉(D)、檸檬酸三銨(E)、K2HPO4·7H2O(F)、MgSO4·7H2O(G)、MnSO4·4H2O(H)、NaAc·3H2O(J)、乳糖(K)、番茄汁(L)共11個因素，各因素水平取值見表1，以嗜酸乳桿菌的活菌濃度為響應(yīng)值進行試驗分析。

表1 二水平部分因子設(shè)計的因素和水平Table 1 Factors and levels of Fractional Factorial Design

1.3.3 最速上升法設(shè)計

響應(yīng)面擬合方程的最優(yōu)鄰域才能充分反映真實情形，最速上升法可以迅速的達到其附近［16］。根據(jù)部分因子設(shè)計試驗結(jié)果中顯著因子的效應(yīng)大小篩選出最大影響因子:牛肉膏(C)、乳糖(K)、番茄汁(L)，并確定最陡爬坡試驗的方向和步長，剩余因子均取低水平值，通過活菌濃度的變化趨勢，確定中心組合設(shè)計試驗中3因素的中心點。

1.3.4 中心組合設(shè)計

根據(jù)FFD試驗和SA試驗中確定的試驗因素和中心點，采用Box-Wilson法進行響應(yīng)面優(yōu)化(見表2)，從而獲得最佳培養(yǎng)基。

1.3.5 驗證性試驗

把LaNCU402以4%(v/v)的接種量分別接種在液體MRS培養(yǎng)基中和優(yōu)化培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)96 h，0～40 h內(nèi)每隔2 h取樣，40～96 h內(nèi)每隔4 h取樣。每次取樣測其活菌濃度、發(fā)酵液pH值、優(yōu)化后發(fā)酵液中葡萄糖及乳酸含量;并以培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制各自變化曲線。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels of Central Composite Design

本研究均使用Design-expert V8.06.01進行試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗篩選嗜酸乳桿菌NCU402基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成成分

2.1.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的確定

以酵母浸出液培養(yǎng)基、乳清粉培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基4種培養(yǎng)基進行培養(yǎng)后結(jié)果如圖1所示。MRS培養(yǎng)基的活菌濃度最高，其次為酵母浸出液培養(yǎng)基。乳清粉培養(yǎng)基在培養(yǎng)時，對數(shù)期初期活菌濃度略高于MRS培養(yǎng)基，但對數(shù)期時發(fā)酵液出現(xiàn)絮狀沉淀，推測為LaNCU402產(chǎn)生的乳酸造成乳清粉中蛋白質(zhì)沉淀，之后活菌濃度不升反降。因此選擇MRS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對其進行優(yōu)化尋找適合LaNCU402的最佳增菌培養(yǎng)基。

圖1 不同培養(yǎng)基中LaNCU402生長曲線Fig.1 Growth curve of LaNCU402 in different culture mediums

2.1.2 生長因子的確定

不同生長因子對LaNCU402的增菌結(jié)果見圖2，除菊糖、低聚果糖、半胱氨酸外，大部分生長因子對LaNCU402有一定的增殖作用。其中番茄汁、脫鹽乳清粉D90和乳糖的增菌效果顯著［17-18］。但脫鹽乳清粉D90在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的絮狀沉淀影響菌體分離和菌劑制備，并且增大工業(yè)生產(chǎn)中管道清洗的工作量，故選取乳糖和番茄汁作為LaNCU402的生長因子。

圖2 不同生長因子對LaNCU402生長的影響Fig.2 Effect of different nutriments on the growth of LaNCU402

2.2 二水平部分因子設(shè)計篩選培養(yǎng)基組成最大影響因子

以LaNCU402活菌濃度(107CFU/mL)為響應(yīng)值進行試驗，設(shè)計矩陣和結(jié)果見表3，各因素的效應(yīng)分析見表4，圖3為各因素Pareto圖。

圖3 各因素Pareto圖Fig.3 Pareto chart of main effect

由表4的效應(yīng)值和各因素Pareto圖可知:葡萄糖、蛋白胨、檸檬酸三銨和乙酸鈉對LaNCU402為負效應(yīng)，即隨著添加量的增大，LaNCU402活菌濃度呈現(xiàn)降低趨勢;由表4的P值和Pareto圖中超越t-Value Limit線的因素可知，牛肉膏對活菌濃度的增長有顯著效果，乳糖和番茄汁對活菌濃度的影響極顯著。該模型的決定系數(shù)為94.51%，校正后的決定系數(shù)有79.42% ＞70%，并且模型的P值為0.0456，證明該模型能較好的擬合數(shù)據(jù)，體現(xiàn)實際情況。分析后選擇牛肉膏、乳糖、番茄汁3個因素作為主要研究對象，對LaNCU402增菌培養(yǎng)基進行進一步優(yōu)化。

2.3 最速上升法確定響應(yīng)面最優(yōu)鄰域

牛肉膏、乳糖、番茄汁3個因素對LaNCU402均為正效應(yīng)，因此上升方向為各因素濃度梯度遞增;以低水平(-1)到高水平(+1)的1/4為步長進行最速上升試驗，具體試驗設(shè)計及結(jié)果如表5所示。

表3 二水平部分因子設(shè)計矩陣和結(jié)果Table 3 Matrix and results of Two-level Fractional Factorial Design

表4 二水平部分因子設(shè)計各因素主效應(yīng)分析結(jié)果Table 4 Results of main effect analysis of Two-level Fractional Factorial Design

表5 最速上升試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Designand results of steepest ascent

由表5的數(shù)據(jù)分析可知，隨著3個因素濃度的增大，LaNCU402活菌濃度為逐漸增大后減小，在序號5組達到最高值。此時各因素含量為:牛肉膏1.2%、乳糖2.25%、番茄汁30%。取5組中各因素含量，其余因素取低水平值，以此為中心組合設(shè)計因素水平的中心點，進行Box-Wilson試驗。

2.4 中心組合設(shè)計優(yōu)化嗜酸乳桿菌NCU402增菌培養(yǎng)基

以牛肉膏(W)、乳糖(X)、番茄汁(Y)3個因素為自變量，LaNCU402活菌濃度為響應(yīng)值，通過Design-expert軟件設(shè)計3因素5水平的Box-Wilson試驗，試驗設(shè)計和結(jié)果如表6所示，軟件分析后得到回歸方程的參數(shù)估計和方差分析，見表7、表8。

進行二次多項回歸擬合后得到擬合回歸方程為:

y=2.760 30+0.093 82W-0.053 07X+0.104 66Y-0.147 5WX-0.280 85WY+0.117 5XY-0.255 47W2-0.178 29X2-0.178 85Y2

表6 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Designand Results of Central Composite Design

表7 回歸方程參數(shù)估計Table 7 Parameter estimation of regression equation

表8 回歸方程方差分析Table 8 Variance analysis of regression equation

式中:y為LaNCU402活菌濃度預(yù)測響應(yīng)值;W為牛肉膏的編碼值;X為乳糖的編碼值;Y為番茄汁的編碼值。

由表7的參數(shù)估計和顯著性分析可知，各因素對LaNCU402活菌濃度的線性效應(yīng)均顯著，影響程度番茄汁＞牛肉膏＞乳糖;各因素交互項和二次項均為極顯著，3因素之間的交互作用較大。

表7中，該模型的決定系數(shù)為97.68%，校正后的決定系數(shù)為95.36%，可說明該模型擬合度好，對真實情況有高度相關(guān)性，只有總變異4.64%的情況不能用該模型解釋;而變異系數(shù)(C.V.)為3.68%，說明模型精準度較高，模型可信;由表8可知，該回歸方程的Prob＞F值小于0.0001，只有0.01%的機會出現(xiàn)噪聲，說明模型差異極顯著;并且失擬檢驗的Prob＞F值為0.2731＞0.05，可見失擬項對于純誤差不顯著，進一步說明該模型能較好擬合實際情況;因此可利用該模型對LaNCU402的生物量進行預(yù)測。

由擬合方程可繪制響應(yīng)面三維分析圖和相應(yīng)的等高線圖(圖4)。每個響應(yīng)面三維分析圖和對應(yīng)的等高線圖分別為當一個變量保持0水平時，另2個獨立變量之間的交互作用。

圖4(A)為Y(番茄汁)含量為編碼0值時，W(牛肉膏)和X(乳糖)的交互作用的等高線圖和相應(yīng)的響應(yīng)面三維分析圖。分析可知，當乳糖含量一定時，隨著牛肉膏添加量的增大，LaNCU402的活菌濃度先增大后減小;由于嗜酸乳桿菌的不完全蛋白分解酶系，蛋白質(zhì)分解能力弱;而嗜酸乳桿菌需要較多外界提供的營養(yǎng)如氨基酸、肽、核酸衍生物等，而牛肉膏當中含有豐富的氨基酸類、核苷酸類、有機酸類、礦物質(zhì)類及維生素類等等營養(yǎng)物質(zhì)，在一定程度上可以滿足菌體的增殖。當牛肉膏含量一定時，隨著乳糖添加量的增大，LaNCU402的活菌濃度先增大后減小;當乳糖濃度恰當時，可以作為LaNCU402的碳源，但當乳糖濃度過大時，大量增殖產(chǎn)生的乳酸會對抑制菌體增殖［19］。

圖4的B圖為X(乳糖)含量為編碼0值時，W(牛肉膏)和Y(番茄汁)的交互作用的等高線圖和相應(yīng)的響應(yīng)面三維分析圖，該圖呈橢圓形，證明二者交互作用較大。當牛肉膏處于-1-0.5水平時，隨著番茄汁含量的增加，活菌濃度也隨著增大;當番茄汁處于-1-0水平時，活菌濃度與牛肉膏含量呈正效應(yīng);而當番茄汁和牛肉膏含量均為高水平時，活菌濃度反而降低。分析認為番茄汁和牛肉膏均為天然產(chǎn)物，可以給LaNCU402帶來較全面的營養(yǎng)物質(zhì)，其中所含的B族維生素和氨基酸都能促進LaNCU402的生長;但當二者含量均高水平時，可能由于物質(zhì)濃度的升高造成高滲透壓和氧化還原電勢，造成細胞死亡，抑制了嗜酸乳桿菌的增長［20］。

圖4 各因素交互作用響應(yīng)面圖及相應(yīng)的等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour map of interactive effects of various factors

圖4的C圖為W(牛肉膏)含量為編碼0值時，X(乳糖)和Y(番茄汁)的交互作用的等高線圖和相應(yīng)的響應(yīng)面三維分析圖。由圖分析有:當番茄汁處于較低水平時，乳糖含量的增加也不能使LaNCU402達到最高活菌濃度，因此番茄汁的增加有利于乳糖對LaNCU402的增殖。

圖4的結(jié)果分析可知，活菌濃度y的最大值既是所得回歸方程存在的最高點。對回歸方程求解最大值可得:當 W=0.215 3、X=-0.214 9、Y=0.053 43，即當牛肉膏為1.458 4%、乳糖為1.766 5%、番茄汁為31.602 9%時，LaNCU402的活菌濃度y達到最大值2.779×109CFU/mL。

2.5 驗證試驗確定模型準確性

為了驗證最優(yōu)培養(yǎng)基和增菌效果的可靠性，以初始MRS培養(yǎng)基為對照進行驗證試驗，其活菌濃度、發(fā)酵液pH值、發(fā)酵液中葡萄糖及乳酸含量的變化曲線結(jié)果如圖5、圖6所示。

從LaNCU402在MRS和優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長曲線可以看出，對數(shù)期大大縮短，由8h提前到4h，穩(wěn)定期由16 h提前到14 h，證明優(yōu)化后的培養(yǎng)基更加有利于LaNCU402的生長;整個生長周期中MRS培養(yǎng)基的最大活菌濃度為5.733×108CFU/mL，優(yōu)化培養(yǎng)基最大活菌濃度為2.8833×109CFU/mL，與模型預(yù)測值基本吻合。而pH變化曲線可以看出優(yōu)化培養(yǎng)基中大量增殖菌體所產(chǎn)生的乳酸多于MRS培養(yǎng)基，在對數(shù)期時下降速率較快，對之后進行培養(yǎng)條件優(yōu)化中的堿流加有著指導意義。

圖5 LaNCU402在兩種培養(yǎng)基中的生長曲線和pH變化曲線Fig.5 pH and growth curve of LaNCU402 in two cultures

圖6 LaNCU402在優(yōu)化培養(yǎng)基中葡萄糖和乳酸的變化曲線Fig.6 the curves of glucose and lactic acid in the optimal culture of LaNCU402

用高效液相色譜測定優(yōu)化后LaNCU402發(fā)酵液中葡萄糖及乳酸含量，以培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制各自變化曲線。由圖6知，在對數(shù)期時，葡萄糖的消耗大大增加，在36 h后趨于穩(wěn)定，從40 h到72 h有緩慢增加趨勢，分析估計是由Cori循環(huán)生成［21］;在對數(shù)期末期到穩(wěn)定期，乳酸的生成速率達到最大，在22 h后平穩(wěn)增長。該組數(shù)據(jù)測定對之后培養(yǎng)條件優(yōu)化中底物流加具有指導意義。

3 結(jié)論

本研究篩選出LaNCU402生長的最大影響因子，通過中心組合設(shè)計對增菌培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到優(yōu)化培養(yǎng)基為:葡萄糖1.5%、蛋白胨1%、牛肉膏1.458 4%、酵母粉 0.4%、檸檬酸三銨 0.2%、K2HPO40.2%、MgSO4· 7H2O 0.02%、MnSO4· 4H2O 0.005%、NaAc·3H2O 0.5%、乳糖1.766 5%、番茄汁31.602 9%、吐溫80 0.1%;活菌濃度可達到2.883 3×109CFU/mL，對比MRS培養(yǎng)基有著明顯的提高，為之后培養(yǎng)條件的優(yōu)化和真空冷凍干燥打下基礎(chǔ)。

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