益生菌Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9在活性乳酸菌飲料中的應(yīng)用*

陳世賢，高鵬飛，王記成，孫 婷，張興昌，司徒文佑，張和平

1(內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，伊利創(chuàng)新中心，內(nèi)蒙古呼和浩特，010110)

2(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特，010018)

益生菌是指一類(lèi)非致病的經(jīng)過(guò)消化系統(tǒng)對(duì)人體健康產(chǎn)生積極作用的微生物［1］，它們通過(guò)改善人體內(nèi)的微生態(tài)平衡進(jìn)而促進(jìn)人體健康。2001年，F(xiàn)AO/WHO(世界糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織)定義益生菌為“一類(lèi)活的微生物，足量攝入后對(duì)宿主健康有益”［2］。因此，足夠的活菌數(shù)量和良好的存活穩(wěn)定性是益生菌用于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及發(fā)揮其益生功能的前提。

L.casei Zhang分離自傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶(koumiss)，具有良好的耐酸性、人工胃腸液耐受性及膽鹽耐受性［3］。研究證明，L.casei Zhang可在小鼠腸道內(nèi)定殖并對(duì)病原性大腸桿菌具有拮抗作用［4］，具有顯著的抗氧化、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤等功效［5-8］。其益生特性通過(guò)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證［9-10］。

B.lactis V9分離自健康蒙古族兒童糞便中，具有穩(wěn)定的遺傳性［11］。B.lactis V9對(duì)人工胃腸液具有良好的耐受性［12］，對(duì)致病菌株(志賀氏痢疾桿菌、沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌、埃希氏大腸桿菌)具有一定程度的拮抗作用，可以有效治療小鼠的腹瀉［13］。臨床研究表明，B.lactis V9具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，對(duì)便秘和急慢性腹瀉患者治療效果顯著［14］。

近幾年，干酪乳桿菌因其特殊的生理功效及風(fēng)味，被廣泛應(yīng)用于活性乳酸菌飲料中，且目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的活性乳酸菌飲料幾乎都是利用干酪乳桿菌單株菌發(fā)酵而成。本研究將L.casei Zhang與B.lactis V9復(fù)配添加到滅菌牛乳中發(fā)酵制備活性乳酸菌飲料，評(píng)價(jià)2株益生菌對(duì)活性乳酸菌飲料風(fēng)味的影響及貨架期內(nèi)的存活穩(wěn)定性，為L(zhǎng).casei Zhang與B.lactis V9在產(chǎn)品中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

益生菌 LactobacilluscaseiZhang(L.casei Zhang)、Bifidobacterium lactis V9(B.animalis V9)，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室友情提供。

1.2 發(fā)酵乳基料的制備

脫脂奶粉(12%)、葡萄糖(3%)(45℃水合30 min)→殺菌(95℃，5 min) →冷卻至 3 7℃ →接種益生菌 →37℃恒溫發(fā)酵 2 0 h →后熟12 h備用

不同樣品中，L.casei Zhang與B.animalis V9的添加量見(jiàn)表1。

1.3 活性乳酸菌飲料樣品的制備

白砂糖(12%)+穩(wěn)定劑(CMC 0.3%、三聚磷酸鈉0.03% ) →50℃ 溫 水溶解 →殺菌(95℃，5 min) →冷卻至 2 0℃ →加入發(fā)酵乳基料 →調(diào)整pH值至4.0→20 MPa 均質(zhì) →成品

表1 樣品中L.casei Zhang和B.animalis V9的添加量Table 1 The addition of L.casei Zhang and B.lactis V9 in different samples

1.4 pH值測(cè)定

將活性乳酸菌飲料樣品調(diào)整溫度至20℃，采用精密pH計(jì)(雷磁PHS-3C，海精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)量。

1.5 活菌數(shù)測(cè)定

L.casei Zhang的選擇性培養(yǎng):將10.0 g活性乳酸菌飲料樣品加入90.0 g蛋白胨水溶液(8.5 g/L NaCl，1.0 g/L 蛋白胨)中，于水平搖床(200 r/min)振搖30 min，然后于上述蛋白胨水溶液梯度稀釋?zhuān)捎肕RS-V(萬(wàn)古霉素50 mg/L)固體培養(yǎng)基平板傾注法，37℃厭氧培養(yǎng)48 h。

B.animalis V9的選擇性培養(yǎng):10.0 g活性乳酸菌飲料樣品于90.0 g PBS水溶液(8.0 g/L NaCl，0.20 g/L KH2PO4，1.15 g/L Na2HPO4，0.50 g/L 半胱氨酸)中，于水平搖床(200 r/min)振搖30 min，然后于上述PBS水溶液梯度稀釋?zhuān)捎媚チ_星鋰鹽(Li-Mupirocin添加量為0.05 g/L)改良MRS瓊脂培養(yǎng)基平板傾注法，37℃厭氧培養(yǎng)72 h。

1.6 活性乳酸菌飲料樣品感官評(píng)定

活性乳酸菌飲料的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 活性乳酸菌飲料的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of active lactobacillus beverage

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵乳基料樣品終點(diǎn)pH值比較

不同發(fā)酵乳基料在37℃下恒溫發(fā)酵20 h后終點(diǎn)pH值如表3所示。

表3 不同發(fā)酵乳基料樣品37℃恒溫發(fā)酵20 h終點(diǎn)pH值比較Table 3 pH comparison of different sample fermented at 37℃for 21 h

由表3中結(jié)果可知，在37℃下恒溫發(fā)酵20 h，益生菌添加活菌數(shù)量越高，發(fā)酵乳基料樣品的終點(diǎn)pH值越低，其中，總添加量為2.0×107CFU/g時(shí)，pH值可達(dá)到4.00;總添加活菌數(shù)相同的前提下，B.animalis V9的添加會(huì)略延緩發(fā)酵乳基料樣品酸度的降低速率，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 貯藏期內(nèi)不同活性乳酸菌飲料樣品pH值的變化

貯藏期內(nèi)不同活性乳酸菌飲料樣品pH值變化見(jiàn)表4。

表4 不同活性乳酸菌飲料樣品在4℃28 d貯藏期內(nèi)pH值的變化Table 4 pH changes of differentactive lactobacillus beverage samples during the storage at 4℃for 28 d

由表4可以看出，4℃下貯藏28 d，不同樣品的pH值均保持在4.00±0.05范圍內(nèi)不變，即6種活性乳酸菌飲料樣品的酸度在貨架期內(nèi)均可以保持穩(wěn)定的水平。

2.3 貯藏期內(nèi)不同活性乳酸菌飲料樣品中益生菌活菌數(shù)的變化

將活性乳酸菌飲料樣品在4℃下貯藏28 d，不同樣品中L.casei Zhang和B.animalis V9活菌數(shù)的變化見(jiàn)圖1。

圖1 不同活性乳酸菌飲料樣品在4℃28 d貯藏期內(nèi)益生菌活菌數(shù)的變化Fig.1 Changes of probiotics viable counts in different active lactobacillus beverage samples during the storage at 4℃for 28 d

由圖1(a)可知，利用L.casei Zhang單獨(dú)發(fā)酵制備活性乳酸菌飲料的最適添加量為1.0×107CFU/g，37℃下恒溫發(fā)酵20 h后按照1.3中工藝調(diào)配，活性乳酸菌飲料樣品中L.casei Zhang的活菌數(shù)達(dá)到3.0×108CFU/g以上，且在4℃ 28 d貯藏期內(nèi)保持高于3.0×108CFU/g水平。

由圖1(b)可知，貯藏期內(nèi)L.casei Zhang+B.animalis V9(1∶1，2.0×107CFU/g)活性乳酸菌飲料樣品中總的益生菌活菌數(shù)可以達(dá)到5.0×108CFU/g以上，其中L.casei Zhang的初始活菌數(shù)約為3.7×108CFU/g，且在4℃ 28 d貯藏期內(nèi)保持高于3.7×108CFU/g水平;B.animalis V9的活菌數(shù)在貯藏期內(nèi)呈逐漸增加的趨勢(shì)，第28天增加至2.7×108CFU/g。說(shuō)明B.animalis V9與L.casei Zhang共同發(fā)酵發(fā)生協(xié)同效應(yīng)，B.animalis V9的添加可促進(jìn) L.casei Zhang的增殖。

由圖1(c)可知，貯藏期內(nèi)L.casei Zhang+B.animalis V9(1∶1，1.0×107CFU/g)活性乳酸菌飲料樣品中總的益生菌活菌數(shù)可以達(dá)到3.5×108CFU/g以上，其中L.casei Zhang的初始活菌數(shù)約為2.5×108CFU/g，后期逐漸減少，第28天時(shí)最低約為2.0×108CFU/g;B.animalis V9的活菌數(shù)在28 d貯藏期內(nèi)保持約1.5×108CFU/g水平穩(wěn)定不變。

由圖1(d)中結(jié)果可知，貯藏期內(nèi)L.casei Zhang+B.animalis V9(1∶1，0.5×107CFU/g)活性乳酸菌飲料樣品中總的益生菌活菌數(shù)小于3.0×108CFU/g，其中L.casei Zhang的初始活菌數(shù)約為2.5×108CFU/g以上，后期逐漸減少，第28天時(shí)最低約為1.5×108CFU/g;B.animalis V9的活菌數(shù)在28 d貯藏期內(nèi)保持約0.5×108CFU/g水平穩(wěn)定不變。

2.3 不同活性乳酸菌飲料樣品感官評(píng)價(jià)結(jié)果

組織11名專(zhuān)業(yè)感官評(píng)價(jià)人員按照表2中標(biāo)準(zhǔn)對(duì)6種不同活性乳酸菌飲料進(jìn)行感官評(píng)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可以看出，將L.casei Zhang與B.animalis V9按照活菌數(shù)1∶1復(fù)配，總活菌數(shù)添加量為2.0×107CFU/g時(shí)，制備的活性乳酸菌飲料在口感和滋氣味方面更有優(yōu)勢(shì)。

表5 不同活性乳酸菌飲料樣品感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 5 Sensory evaluation result of differentactive lactobacillus beverage samples

3 討論

目前市場(chǎng)上的活性乳酸菌飲料幾乎都是通過(guò)干酪乳桿菌單株菌長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵調(diào)配而成的，國(guó)內(nèi)該類(lèi)產(chǎn)品的產(chǎn)量逐年攀升，養(yǎng)樂(lè)多、味全、蒙牛、伊利相繼推出該類(lèi)產(chǎn)品［15］。貨架期內(nèi)酸度、風(fēng)味及乳酸菌活菌含量是活性乳酸菌飲料產(chǎn)品質(zhì)量高低評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。研究結(jié)果顯示:

(1)當(dāng)總?cè)樗峋砑恿繛?.0×107CFU/g時(shí)，發(fā)酵乳基質(zhì)的pH值可達(dá)到理想值4.00。

(2)利用L.casei Zhang單獨(dú)發(fā)酵制備活性乳酸菌飲料的最適添加量為1.0×107CFU/g，4℃ 28 d貯藏期內(nèi)保持高于3.0×108CFU/g水平。

(3)最佳復(fù)配發(fā)酵組合為L(zhǎng).casei Zhang+B.animalis V9(1∶1，2.0×107CFU/g)，4 ℃ 28 d貯藏期內(nèi)樣品中總的益生菌活菌數(shù)保持5.0×108CFU/g以上，且在口感和滋氣味方面感官評(píng)價(jià)分值最高。

由此可見(jiàn)，益生菌L.casei Zhang和B.animalis V9適合用于活性乳酸菌飲料產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，2株菌在共同發(fā)酵過(guò)程中會(huì)發(fā)生協(xié)同效應(yīng)，B.animalis V9的添加可促進(jìn)L.casei Zhang的增殖，且有利于改善L.casei Zhang單株發(fā)酵樣品的感官品質(zhì)。

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