同種屬來源一抗在免疫熒光雙標(biāo)記染色中的可行性

陳 曦 劉 哲 鄧茂林 馮 軾

（成都大學(xué) 附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，成都610041）

近年來，免疫熒光染色技術(shù)在生物及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的科學(xué)研究中運(yùn)用越來越廣泛，當(dāng)需要在同一組織／細(xì)胞上檢查兩種不同抗原時(shí)，則需要進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記染色［1］。順序法免疫熒光雙標(biāo)記染色因?yàn)椴僮髁鞒虖?fù)雜、操作時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)而瀕于淘汰，但實(shí)際的科研工作中受實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)、條件等限制，常常遇到一抗種屬來源相同無法進(jìn)行同步法免疫熒光雙標(biāo)記染色的情況。本研究通過對(duì)小鼠結(jié)腸組織白細(xì)胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）［2］和腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Glial cell line-derived neurotro-phic factor，GDNF）特異性受體亞基 GFR-α1（GDNF family receptor-α1，GFR-α1）［3］進(jìn)行的種屬來源一抗順序法免疫熒光雙標(biāo)記染色，探討了特異性分泌IL-17的腸Th17細(xì)胞中GDNF受體的表達(dá)，并對(duì)如何避免同種屬來源一抗的交叉染色等問題進(jìn)行了分析討論。

1 材料與方法

1．1 主要試劑

Balb／c小鼠購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulfate sodium，DSS）購(gòu)自Pharmacia Corporation公司。兔抗鼠抗IL-17抗體和兔抗鼠抗GFR-α1抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，四甲基異硫氰酸羅丹明（Tetramethylrhodam-ine，TRITC）標(biāo)記山羊抗兔二抗和異硫氰脂熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1．2 構(gòu)建動(dòng)物模型

參考Cooper等［4］的文獻(xiàn)報(bào)道構(gòu)建小鼠DSS結(jié)腸炎模型。將4-6周齡、體重約20g的Balb／c雌性小鼠以5%（w／v）的DSS溶液讓小鼠自由飲用，每天光照／黑暗各12小時(shí)，1周后處死小鼠取結(jié)腸組織迅速冰凍切片。

1．3 順序法免疫熒光雙染

組織冰凍切片95%酒精室溫固定10分鐘，PBS洗3次，每次5分鐘，1%Triton X-100室溫處理10分鐘，PBS洗3次，10%山羊血清37℃封閉1小時(shí)，去除山羊血清（不用PBS清洗），抗GFR-α1抗體（1∶500稀釋）4℃孵育過夜，室溫復(fù)溫30分鐘，PBS洗3次（以下步驟避光），F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔二抗37℃孵育1．5小時(shí)，PBS洗3次。10%山羊血清37℃再次封閉1小時(shí)。抗IL-17抗體（1∶200稀釋）37℃孵育1小時(shí)，PBS洗3次，TRITC標(biāo)記山羊抗兔二抗37℃孵育1小時(shí)，PBS洗3次。抗粹滅封片液封片后于熒光顯微鏡下觀察拍照。分別設(shè)置一抗A陰性（孵育一抗A時(shí)以PBS代替）和一抗B陰性（孵育一抗B時(shí)以PBS代替）的單陰對(duì)照組。

2 結(jié)果

如圖1所示，在小鼠結(jié)腸黏膜層、黏膜下層、肌層均可見廣泛的GFR-α1表達(dá)，呈FITC標(biāo)記的綠色，而在黏膜及黏膜下層亦可見IL-17表達(dá)，呈TRITC標(biāo)記的紅色。盡管冰凍切片組織結(jié)構(gòu)欠清晰，但在兩種不同熒光的對(duì)比之下，可以看到黏膜及黏膜下層可見被綠色熒光和紅色熒光雙重標(biāo)記的陽性細(xì)胞，提示IL-17＋的Th17細(xì)胞表面有GDNF特異性受體亞基GFR-α1表達(dá)。一抗A陰性的對(duì)照組，除了殘留的少量雜質(zhì)以外，目標(biāo)組織幾乎不顯示綠色熒光，一抗B抗陰性的對(duì)照組，仍可見紅色熒光顯色，但其強(qiáng)度較弱，可基本被綠色熒光覆蓋。

3 討論

熒光免疫雙染分為直接法和間接法。直接法是指采用不同顏色熒光素直接標(biāo)記的兩種抗體同時(shí)孵育目標(biāo)組織并顯色的方法，這種方法優(yōu)點(diǎn)是特異性高，可以有效的避免兩種抗體的交叉反應(yīng)，缺點(diǎn)是敏感性相對(duì)較低、且直接標(biāo)記熒光素的一抗價(jià)格昂貴。間接法又分為同步法和順序法，同步法是指兩種不同種屬來源的一抗混合同時(shí)孵育目標(biāo)組織，然后再采用不同顏色熒光素標(biāo)記的二抗混合同時(shí)孵育目標(biāo)組織，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是特異性和敏感性兼顧，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，性價(jià)比較高，因而是目前免疫熒光雙標(biāo)染色最常使用的方法［5］。但當(dāng)兩種抗原存在同一部位時(shí)，同步法的其中一種一抗可能會(huì)妨礙另一種一抗與抗原的結(jié)合，導(dǎo)致另一種抗原檢測(cè)的敏感性降低，此時(shí)，采用順序法，先染色含量較少的抗原，再染色含量較多的抗原，盡管實(shí)驗(yàn)操作流程更為復(fù)雜，但可明顯提高含量較少的抗原顯色的敏感性［6］。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，抗原的識(shí)別主要依賴一抗，二抗結(jié)合一抗的Fc段，是非特異性的識(shí)別，因此，即使是順序法，也應(yīng)該采用兩種不同種屬來源的一抗，以此避免兩種二抗的交叉反應(yīng)。但實(shí)際工作中常常受實(shí)驗(yàn)條件所限，當(dāng)有且僅有同一種屬來源的兩種一抗時(shí)，是不是就一定無法作出可信的免疫熒光雙染結(jié)果呢？

圖1 腸Th17細(xì)胞中GDNF受體的表達(dá)

首先，我們要清楚順序法間接熒光免疫雙染采用同種屬來源一抗產(chǎn)生交叉反應(yīng)的原因。第一，當(dāng)二抗A不足夠結(jié)合一抗A時(shí)，余留的一抗的Fc段便可能與后來加入的二B結(jié)合產(chǎn)生交叉反應(yīng)，針對(duì)第一種情況，如果我們使用的二抗A足量甚至略超過一抗A的結(jié)合力、孵育時(shí)間又足夠長(zhǎng)時(shí)，理論上是可以讓一抗A的Fc段完全被二抗A結(jié)合的［7］，但這樣就可能帶來第二種交叉反應(yīng)產(chǎn)生的可能，即過量的二抗A清洗不干凈時(shí)，后加入的一抗B可能會(huì)與二抗A反應(yīng)，產(chǎn)生假陽性結(jié)果，針對(duì)第二種情況，徹底的清洗理論上也可以避免。還有人提出第三種交叉反應(yīng)的可能，因?yàn)槊總€(gè)抗體的結(jié)合位點(diǎn)不止一個(gè)，如果二抗A超量，那么很可能其與一抗A結(jié)合后仍有空著的位點(diǎn)仍有可能與一抗B結(jié)合，再加入二抗B時(shí)，又與二抗B結(jié)合，這樣就出現(xiàn)了重標(biāo)，針對(duì)第三種情況，又有人提出，既然二抗是非特異性的，那么一抗B之前再次使用二抗同源血清封閉，有可能封閉二抗B未結(jié)合的位點(diǎn)，避免交叉反應(yīng)。因此，當(dāng)一抗為同種屬來源時(shí)，適當(dāng)增加二抗A的濃度并予足夠的孵育時(shí)間、徹底清洗，延長(zhǎng)血清封閉時(shí)間并適當(dāng)減少一抗B的濃度，理論上是有可能避免抗體之間交叉反應(yīng)的。本研究將二抗A的濃度提高為說明書推薦濃度的2倍，延長(zhǎng)孵育時(shí)間至1．5小時(shí)，在一抗A和一抗B使用之前均進(jìn)行二抗同源血清封閉，封閉時(shí)間延長(zhǎng)至1小時(shí)，為減少二抗A的熒光粹滅，一抗B于37℃孵育1小時(shí)。結(jié)果可見結(jié)腸黏膜及黏膜下層被綠色熒光和紅色熒光雙重標(biāo)記的陽性細(xì)胞，并沒有出現(xiàn)因?yàn)榻徊娣磻?yīng)導(dǎo)致兩種熒光表達(dá)位置重疊而無法達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡那闆r。

為了進(jìn)一步探討順序法染色所致的交叉反應(yīng)對(duì)結(jié)果判斷的影響，我們分別設(shè)置了一抗A陰性和一抗B陰性的對(duì)照組。結(jié)果顯示，一抗A陰性的對(duì)照組，除了殘留的少量雜質(zhì)以外，目標(biāo)組織幾乎不顯示綠色熒光，證實(shí)我們的清洗方法可徹底清洗非特異性吸附的熒光二抗，有效避免了殘留熒光二抗A與一抗B交叉反應(yīng)的可能。而一抗B抗陰性的對(duì)照組，仍可見強(qiáng)度較弱的紅色熒光顯色，在實(shí)驗(yàn)操作中，我們已經(jīng)加入了足夠結(jié)合一抗A的二抗A并予以了足夠長(zhǎng)的孵育時(shí)間，故殘留未結(jié)合的一抗A Fc段與二抗B結(jié)合的可能性較小，而由于一抗B之前再次使用二抗同源血清封閉二抗B未結(jié)合的位點(diǎn)的方法缺乏可靠的文獻(xiàn)依據(jù)，因此，我們推測(cè)一抗B抗陰性的對(duì)照組仍可見部分紅色熒光顯色的原因可能為血清封閉其實(shí)并不能很好的封閉掉有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的二抗A中未予一抗A結(jié)合的點(diǎn)，因此仍可能導(dǎo)致部分交叉反應(yīng)，而這種交叉反應(yīng)引起的非特異性染色，應(yīng)該是與一抗A位置幾乎重疊的，這也是許多研究員采用順序法染色得出兩種熒光表達(dá)位置完全相同的原因。盡管如此，對(duì)照組的紅色熒光強(qiáng)度明顯弱于實(shí)驗(yàn)組，真正的紅色熒光陽性著色部分熒光強(qiáng)度與綠色熒光強(qiáng)度相同甚至更高，使雙標(biāo)陽性的細(xì)胞顯示出明亮的橙色或黃色，已有研究發(fā)現(xiàn)，尤其當(dāng)兩種目標(biāo)抗原表達(dá)位置不同時(shí)，兩種熒光重疊后并不會(huì)因?yàn)榻徊娣磻?yīng)所致的非特異性染色而無法判斷陽性結(jié)果［8］。正如我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，綠色熒光的范圍明線比紅色熒光的范圍廣，提示除IL-17＋細(xì)胞外，DSS小鼠結(jié)腸炎模型的結(jié)腸組織中還有許多其他細(xì)胞也表達(dá)GFR-α1，這一結(jié)果亦與既往文獻(xiàn)報(bào)答相符［9，10］。

綜上所述，采用順序法進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記染色，尤其是當(dāng)已知兩種目標(biāo)抗原表達(dá)位置不同時(shí)，通過調(diào)整抗體濃度、加強(qiáng)封閉及徹底清洗等辦法，同一種屬來源的一抗仍可得出可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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