抑郁癥大鼠腦組織、血清中PICK 1的表達及意義

王日德，衛(wèi)兵艷(朔州市復(fù)退軍人精神病院精神科，懷仁 038300;山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)

抑郁癥是常見的心境障礙性疾病之一，主要表現(xiàn)為情緒、意志及思維活動的低落和退行性改變，隨著社會競爭的日益激烈和人們生活節(jié)奏的改變，抑郁癥的發(fā)病率逐年上升，但其發(fā)病機制至今尚不明確。PICK1全稱為蛋白激酶Cα相互作用蛋白(protein interacting with Cα kinase 1)，在哺乳動物各組織廣泛表達，并以腦組織含量最高［1］。據(jù)報道，PICK1參與學(xué)習(xí)、記憶、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、外周神經(jīng)感覺等多種生理功能［2-4］，與癲癇、帕金森綜合征、精神分裂等神經(jīng)精神疾病相關(guān)［5-7］，最近的研究表明，PICK1可能在抑郁癥的發(fā)病中發(fā)揮潛在作用［8］。本研究通過建立大鼠抑郁癥模型，觀察PICK1在抑郁癥大鼠腦組織、血清中的表達水平，為抑郁癥的機制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

30只清潔級雄性Wistar大鼠由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體重(210±17)g，隨機分為兩組:抑郁癥模型組(n=15)和正常對照組(n=15)。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度22℃，濕度95%，對照組大鼠12 h明暗交替，抑郁組大鼠按照刺激方法給予持續(xù)光照或黑暗。

1.2 大鼠抑郁癥模型的建立及評價

［9］的方法，采用慢性溫和不可預(yù)見性刺激(chronic unpredicted mild stress，CUMS)建立模型，主要刺激包括:禁水及禁食24 h、冷熱水游泳5 min、貓叫聲音30 min、持續(xù)光照及黑暗24 h、限制行為24 h、傾斜鼠籠24 h、搖床晃動30 min、夾尾懸吊5 min、電刺激足底1 min。每日一種刺激，順序隨機，使動物不能預(yù)料刺激的發(fā)生，每種刺激累計使用2-3次，刺激持續(xù)28 d。通過體重測量、暢箱實驗、糖水消耗實驗及Morris水迷宮實驗進行行為學(xué)檢測。體重測量:計算實驗始末體重變化率，公式:體重變化率=(第28天體重-第1天體重)/第1天體重×100%。暢箱實驗:單只大鼠置于整潔光亮的敞箱(體積:100 cm×100 cm×50 cm)中央，敞箱底面分為25個等邊方格，記錄大鼠5 min內(nèi)水平運動、垂直運動得分;糖水消耗實驗:剝奪飲水2.5 h后，每籠同時給予純凈水及1%蔗糖水各一份，計算1 h蔗糖水消耗量;Morris水迷宮實驗:每天5個循環(huán)，記錄大鼠在1 min內(nèi)尋找水面下平臺的時間，連續(xù)測試3 d，取3 d的測試成績計為動物的空間記憶成績。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗

最后一次行為測定后采集兩組大鼠尾靜脈血1 ml，室溫靜置10 min，離心(10 min，3 000r/min)取血清。ELISA法檢測兩組大鼠血清PICK1的表達水平，檢測步驟嚴格按照試劑說明書(Mercodia，EIA-04500)進行。

1.4 蛋白印跡法

最后一次行為測定后，采用頸椎脫臼猝死法迅速處死大鼠，皮膚消毒后打開顱腔取腦組織。電子天平稱取腦組織0.1 g，常規(guī)提取蛋白，分光光度計檢測OD值，標準曲線法計算蛋白含量。采用蛋白印跡法(Western blot)檢測腦組織PICK1蛋白的相對表達量:8%聚丙烯酰胺凝膠分離電泳，電泳電壓100 V，時間50 min;冰水濕轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，轉(zhuǎn)膜電壓100 V，時間30 min;蛋白封閉，滴加一抗(PROTEINTECH，PICK1濃度1∶800;Santa-cruz，GAPDH濃度1∶1 000)4℃過夜反應(yīng);洗膜，滴加二抗(北京中杉金橋，濃度1∶3 000)室溫反應(yīng)1 h;ECL發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光顯色并進行灰度分析，目的蛋白PICK1的相對表達量取其與GAPDH的灰度值比值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑郁癥模型行為評價

與正常對照組大鼠相比，抑郁模型組大鼠體重增長、糖水偏好、水平運動、垂直運動明顯降低(P＜0.05)，逃避潛伏期明顯延長(P ＜0.05，見表1)，說明抑郁模型建立成功。

表1 CUMS對大鼠體重增長、敞箱實驗運動、糖水偏好及逃避潛伏期的影響Table 1 The effect of CUMS on body weight，open field test，sucrose preference test and escape latency

2.2 兩組大鼠外周血中PICK1的表達水平

ELISA結(jié)果顯示，正常對照組大鼠外周血PICK1的表達量為(30.83 ±8.20)ng/L，抑郁模型組大鼠外周血PICK1的表達量為(34.84±5.57)ng/L，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.993，P=0.344 ＞0.05)。

2.3 兩組大鼠腦組織中PICK1的表達水平

Western blot結(jié)果顯示，正常對照組大鼠腦組織中PICK1的相對表達量為0.164±0.025，抑郁模型組大鼠腦組織中PICK1的相對表達量為0.706±0.080，明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-14.435，P=0.000 ＜0.05，見圖1)。

圖1 兩組大鼠腦組織中PICK1的表達水平Figure 1 The expression of PICK1 protein in brain tissues in two groups

3 討論

PICK1是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能廣泛的蛋白質(zhì)，同時兼有PDZ、BAR及酸性氨基酸區(qū)三種特殊功能區(qū)，由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，PICK1發(fā)揮著多種生理功能，并且與多種疾病的病理過程相關(guān)。在帕金森綜合征中，PICK1蛋白的單泛素化來介導(dǎo)使酸性敏感性離子通道蛋白2α通路活性增強，促進帕金森病中的神經(jīng)退行性變［6］。PICK1相關(guān)位點等位基因的組成在精神分裂癥患者和正常人之間有顯著差異，說明PICK1很可能在精神分裂癥的發(fā)病機制中發(fā)揮一定的作用［10］。此外，PICK1還與藥物成癮、疼痛以及癌癥等疾病相關(guān)［11-13］，而目前，PICK1在抑郁癥中的研究報道較少。

本研究采用慢性溫和不可預(yù)見性的應(yīng)激方法建立抑郁癥大鼠模型，經(jīng)過不可預(yù)見的禁水、禁食、冷熱水游泳、貓叫聲音、持續(xù)光照及黑暗、限制行為、傾斜鼠籠、搖床晃動、夾尾懸吊、電刺激足底等刺激后，采用體重增長、糖水偏好、敞箱實驗、Morris水迷宮實驗來進行動物行為變化評價，研究結(jié)果顯示:與正常對照組大鼠相比，28 d時抑郁模型組大鼠體重增長、糖水偏好、水平運動、垂直運動明顯降低，逃避潛伏期明顯延長，說明抑郁癥大鼠模型建立成功。進一步，我們分析了兩組大鼠腦組織中PICK1蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，抑郁癥大鼠腦組織中PICK1蛋白的表達量較正常對照大鼠顯著上調(diào)，提示PICK1可能參與了抑郁癥發(fā)生發(fā)展的病理過程，并且這樣的作用主要發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，就可能的機制而言，目前的報道表明 PICK1可與多巴胺、去甲腎上腺素以及5-羥色胺等單胺轉(zhuǎn)運蛋白相結(jié)合，這種功能紊亂可導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)傳遞異常，從而引起中樞退行改變［14］。另外，大腦的酸性敏感性離子通道蛋白屬于哺乳動物退化蛋白及上皮Na+通道蛋白家族，PICK1中的PDZ結(jié)構(gòu)域可同酸性敏感性離子通道蛋白相互作用，在酸性物質(zhì)引起的傷害感受中起作用［15］。通過ELISA分析不同組別外周血發(fā)現(xiàn)，雖然抑郁癥大鼠血清PICK1的濃度較正常對照大鼠有所升高，但差異并不明顯，我們認為這可能與PICK1在體內(nèi)分布情況有關(guān)，由于PICK1在腦組織中的含量最高，在其他組織中的含量較低，因此在腦組織中的變化最為明顯。

綜上所述，PICK1作為一種功能多樣的蛋白質(zhì)，在抑郁癥動物模型腦組織中表達異常，可能參與了抑郁癥發(fā)生發(fā)展的病理過程，而究竟PICK1的表達異常與抑郁癥的發(fā)生何為因果，尚待功能研究進一步證實。

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