弱后酸化德氏乳桿菌保加利亞亞種生理特性的探究

曹鳳波，李媛媛，劉賓，周晶，王曉明，霍貴成

（東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，哈爾濱150030）

0 引言

酸奶因其良好的風味和諸多益生作用而成為最受消費者喜愛的發(fā)酵乳制品之一[1]。目前就乳酸菌的生化反應和生理特性做了大量研究，但更側(cè)重于碳代謝，氮代謝等，而菌株在加工處理過程中對環(huán)境脅迫的忍受能力也同樣需要予以重視[2]。乳酸菌作為單細胞細菌，有較高的體表比，它們對環(huán)境變化的適應和靈活反應是生長和代謝的前提[3]。本實驗室已篩選出兩株低溫產(chǎn)酸慢，高溫產(chǎn)酸快且發(fā)酵性能優(yōu)良的弱后酸化德氏乳桿菌保加利亞亞種[4-5]，為了探究其生長能力及對環(huán)境的適應能力，現(xiàn)對其最適生長溫度，耐酸力和耐冷凍能力等進行測定，以更好的培養(yǎng)，優(yōu)化和制作發(fā)酵劑，為今后的試驗和生產(chǎn)做鋪墊。

1 實驗

1.1 材料與試劑

菌種：從乳品科學教育部重點實驗室菌種保藏中心（KLDS-DICC）篩選出的兩株弱后酸化德氏乳桿菌保加利亞亞種KLDS1.1011、KLDS1.1006[4]和具有優(yōu)良發(fā)酵性能的對照菌KLDS1.9201[6]。

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基。

主要試劑：偏磷酸緩沖鹽，生理鹽水等。

1.2 儀器與設備

Delta320精密pH計，DU-800紫外分光光度計，GL-21M高速冷凍離心機，BCN1360型生物潔凈工作臺，SPX-150B生化培養(yǎng)箱，HIRAYAMA HVE-50形高壓滅菌器等。

1.3 方法

1.3.1 生長性能的測定

將試驗菌種與對照菌活化兩代后以3%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)，分別于0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，36和48 h取樣測定菌體濃度。

（1）分光光度法測定菌體濃度。利用DU800紫外分光光度計在波長600 nm下測定不同時間菌液的吸光值，以未接過種的培養(yǎng)液為空白對照。

（2）pH值法測定菌體濃度。利用DELTA320精密pH計測定不同時間的pH值。

（3）平板菌落計數(shù)法測定菌體濃度。將0.5 mL菌液加到4.5 mL滅菌的質(zhì)量分數(shù)為0.85%生理鹽水中，依次10倍稀釋，選取合適的稀釋倍數(shù)進行涂布，同一稀釋度取三個平行，在恒溫培養(yǎng)箱中42℃培養(yǎng)72 h，選菌落數(shù)分布在30～300之間的平板計菌落數(shù)。

1.3.2 菌株最適生長溫度的測定

將KLDS1.1006和KLDS1.1011按3%的接種量各接到60支MRS液體培養(yǎng)基試管中。分別在30，33，36，39，42、45℃下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個培養(yǎng)箱中放入20支試管，每株菌各10支。于 6，12，24，36和48 h時從每個培養(yǎng)箱中各取2支，采用平板菌落計數(shù)法進行活菌計數(shù)并測定pH值。制作各菌不同溫度的生長曲線[7]。

1.3.3 耐酸能力的測定

將活化好的 KLDS1.1011，KLDS1.1006，KLDS 1.9201接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)16 h后，每個樣各取3%的接種量分別接種于pH值為3.0，4.5，5.5，6.5的 MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)12 h。采用平板菌落計數(shù)法計算活菌數(shù)[8]。

1.3.4 耐冷凍能力的測定

將活化好的 KLDS1.1011，KLDS1.1006，KLDS 1.9201接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)16 h，分別取10 mL菌液，6 000 r/min離心20 min，收集的菌體用等體積的PBS緩沖液洗脫，6 000 r/min離心20 min，重復兩次。將收集的菌體分散于10 mL脫脂乳培養(yǎng)基中，混勻后分裝于安培瓶中凍干。凍干前后分別取樣，采用平板菌落計數(shù)法測定活菌數(shù)。

1.3.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析（P＜0.05），每組重復3次，最終結果表示方式為平均值±標準差。相同字母代表差異性不顯著，不同字母代表差異性顯著。

2 結果與討論

2.1 菌株生長性能的分析

在描述菌株生長曲線時，分光光度法簡單，快捷，可以較準確體現(xiàn)菌株生長的前三個周期，但是因為測定的是濁度，把死菌及其他懸浮物也估算在內(nèi)，對衰退期無法估量；菌株的生長速度與菌株的代謝和產(chǎn)酸有直接關系，pH值法通過乳酸菌產(chǎn)酸的變化值可以粗略模擬其生長變化；活菌計數(shù)法可以真實反映體系中的活菌數(shù)的變化，但操作較為繁瑣[9]。本研究結合這三種方法對菌株的生長能力進行測定，可以較全面的反映細菌的生長特性。

圖1～圖3結果顯示，在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨著時間的延長，菌株的活菌數(shù)是先增加后減少。試驗菌株KLDS1.1006和KLDS1.1011的生長能力顯著低于對 照 菌 株 KLDS1.9201（P＜0.05）。 KLDS1.1006 和KLDS1.1011在12 h左右已經(jīng)進入穩(wěn)定期，而KLDS 1.9201繼續(xù)繁殖，在16 h左右進入穩(wěn)定期，OD值是其他兩株菌的1.5倍，pH值最終穩(wěn)定在3.8，KLDS1.1006和KLDS1.1011分別是4.2和4.5。在活菌數(shù)變化曲線中，KLDS1.9201和KLDS1.1006在24 h以后雖有下降趨勢，并不顯著（P＞0.05），KLDS1.1011的菌數(shù)發(fā)生了明顯的減少（P＜0.05）。可見三種曲線皆能體現(xiàn)菌株的生長狀況。菌株生長能力較低導致了其產(chǎn)酸能力較弱，H+-ATPase活性對調(diào)節(jié)保加利亞乳桿菌的能量代謝和生長意義重大，因此推測生長較弱的菌株可能是由于它的H+-ATPase較低，很大程度上降低了菌株的底物磷酸化水平，導致ATP的產(chǎn)生量隨之減少，對外表現(xiàn)為低生長率和弱產(chǎn)乳酸能力[4]。

圖1 菌株OD600值變化曲線

圖2 菌株pH值變化曲線

圖3 菌株活菌數(shù)變化曲線

2.2 菌株最適生長溫度的分析

乳酸菌一般都屬于嗜溫或嗜熱類微生物，生長環(huán)境多在30～45℃的范圍內(nèi)。為了探究試驗菌株最適的生長環(huán)境，分別取這個溫度范圍的梯度變化進行生長曲線繪制。試驗發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，菌株的生長能力依次上升，當溫度大于42℃時活菌數(shù)反而下降（見圖4和圖5）。說明，KLDS1.1011和KLDS1.1006的最適生長溫度為42℃。細菌受溫度的影響主要因為代謝參與的酶存在著最適溫度，在合適的溫度下可以加快代謝速度，促進其繁殖，提高生長能力。

圖4 KLDS1.1011在不同溫度下活菌數(shù)的變化曲線

圖5 KLDS1.1006在不同溫度下活菌數(shù)的變化曲線

2.3 菌株耐酸能力的分析

圖6為酸脅迫對菌株活力的影響。由圖6可以看出，三株保加利亞乳桿菌在pH值為5.5的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h時的活菌數(shù)高于其他pH值的培養(yǎng)基，說明該菌種更適宜于在偏酸性環(huán)境生長。當pH值降到4.5，也就是酸奶發(fā)酵終止的pH值時，活力有所下降，但仍都保持在106cfu/mL以上。pH值為3.5時，活菌數(shù)顯著下降（P＜0.05），KLDS1.1006、KLDS 1.1011和KLDS1.9201的活菌數(shù)減少量分別是pH值6.5的99.67%，99.83%和98.34%，在相同條件下，試驗菌株較對照菌KLDS1.9201對酸更為敏感。

在酸性條件下，乳酸菌利用質(zhì)膜的H+-ATPase將細胞內(nèi)質(zhì)子泵出到胞外以提高胞內(nèi)pH值，使其維持近中性，以保證菌體自身代謝的正常進行。生長力較弱的菌株，在pH降低的情況下，H+-ATPase酶活性不能很快增加，所以不能迅速地將細胞內(nèi)H+排出體外，以維持細胞內(nèi)pH的恒定，表現(xiàn)出一定的酸敏感性。可見菌株較弱的生長能力和對酸性環(huán)境的較高敏感性，有助于菌株在pH值降到一定值后就不能再繼續(xù)生長，代謝乳糖產(chǎn)酸，有助于降低酸奶在貯存過程中的后酸化程度，從而使酸奶產(chǎn)品的酸度維持在理想水平[10]。

圖6 酸脅迫對菌株活力的影響

2.4 菌株耐冷凍能力的分析

保加利亞乳桿菌作為酸奶發(fā)酵劑，在凍干和低溫保存時，需要暴露于較低的溫度下，其對低溫冷凍刺激的適應能力對發(fā)酵和儲存都有重要的意義[11]。在圖7中，三株菌在僅以脫脂乳為保護劑的情況下凍干，活菌數(shù)有所下降，但高于106mL-1，達到了FAO/WHO建議食品中活菌數(shù)應在106～107g-1以上的要求，其中試驗菌KLDS1.1006和KLDS1.1011的存活率分別是38.90%和54.95%，顯著高于對照菌株KLDS1.9201（P＜0.05），且KLDS1.1011的抗冷凍能力強于KLDS1.1006。

細菌的環(huán)境溫度驟降，生理功能遭到嚴重的破壞，如細胞膜流動性下降，DNA的超螺旋架構發(fā)生改變，以及DNA和RNA穩(wěn)定的二級結構遭到破壞而影響其復制，轉(zhuǎn)錄和翻譯等。不同菌株對凍干的抵抗力有所不同，由試驗結果可知，試驗菌株的冷適應性比對照菌株強[3]。

圖7 冷凍對菌株活力的影響

3 結論

通過對篩選的兩株弱后酸化的保加利亞乳桿菌的生理特性進行測定，以探究其生長能力，最適生長溫度，對酸和冷凍的耐受能力，為今后深入的研究打下基礎。試驗結果表明，試驗菌株KLDS1.1011和KLDS1.1006進入穩(wěn)定期的時間較短，但生長能力弱于對照菌KLDS1.9201，說明生長能力與后酸化存在著密切的關系。這種后酸化能力較弱的菌種作為發(fā)酵劑可以有效改善儲藏期酸奶過酸味及質(zhì)構問題，與益生菌共同發(fā)酵，因其生長力弱，產(chǎn)酸少，較少的抑制雙歧桿菌等的生長，提高其存活率[12]，故存在很大的市場前景。在不同溫度下，菌株的生長

能力有所不同，在42℃下達到最大，說明兩株菌的最適生長溫度為42℃。耐酸性試驗表明，對酸較敏感的菌株其后酸化也較弱。對酸性環(huán)境敏感，有利于菌株在pH降到一定后不再繼續(xù)產(chǎn)酸，可有效降低酸奶在儲藏過程中的后酸化程度。菌株在劇烈的冷凍條件下能夠存活是因為有冷應激蛋白的產(chǎn)生[13]，本研究中，試驗菌株抗冷凍的能力強于對照菌，可見其具有優(yōu)良發(fā)酵劑的潛能，有進一步進行研究的價值。

[1]ONGOL M P,SAWATARI Y,EBINA Y,et al.Yoghurt fermented by Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus H+-ATPase-defective mutants exhibits enhanced viability of Bifidobacterium breve during storage[J].International journal of food microbiology,2007,116(3):358-366.

[2]GREGORET V,PEREZLINDO M J,VINDEROLA G,et al.A comprehensive approach to determine the probiotic potential of human-derived Lactobacillus for industrial use[J].Food microbiology,2013,34(1):19-28.

[3]GOBBETTI M,DE ANGELIS M,CORSETTI A,et al.Biochemistry and physiology of sourdough lactic acid bacteria[J].Trends in food science&technology,2005,16(1):57-69.

[4]孫懿琳.后酸化保加利亞乳桿菌菌株的篩選及其后酸化機理[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學,2013.

[5]曹鳳波,周晶,王曉明,等.兩株弱后酸化保加利亞乳桿菌發(fā)酵性能的研究[J].食品工業(yè)科技,2014,21.

[6]李艾黎,都立輝,霍貴成.保加利亞乳桿菌分批發(fā)酵工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2006,26(12):57-59.

[7]鞏東輝,季祥,趙文杰,等.兩株乳酸菌的生理特性研究[J].內(nèi)蒙古科技大學學報,2007,26(4):353-355.

[8]WANG X,REN H,LIU D,et al.H+-ATPase-defective variants of Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus contribute toInhibition of postacidification of yogurt during chilled storage[J].Journal of Food Science,2013,78(2):207-302.

[9]杜青平,王倩,曹立創(chuàng),等.懸浮物變化引起細菌JS17生長曲線的波動規(guī)律[J].廣東工業(yè)大學學報,2012,29(3):77-80.

[10]霍貴成,崔蘭,劉飛.H+-ATPase弱化菌株的篩選及其應激性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2012,43(5):1-5.

[11]VAN DE GUCHTE M,SERROR P,CHERVAUX C,et al.Stress responses in lactic acid bacteria[J].Antonie Van Leeuwenhoek,2002,82(1-4):187-216.

[12]ASHRAF R,SHAH N P.Selective and differential enumerations of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus,Streptococcus thermophilus,Lactobacillus acidophilus,＜ i＞ Lactobacillus casei and Bifidobacterium spp.in yoghurt—A review[J].International journal of food microbiology,2011,149(3):194-208.

[13]PHADTARE S.Recent developments in bacterial cold-shock response[J].Current issues in molecular biology,2004,6(2):125-136.