應用菌落免疫印跡技術測定多菌株發(fā)酵乳中鼠李糖乳桿菌生長與存活特征

楊振泉,貢湘磊，葉平,徐同林，高璐,顧瑞霞

（1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州 225127；2.江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇揚州225127；3.泰州市產品質量監(jiān)督檢驗所,江蘇泰州 225309）

0 引言

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）具有平衡腸道菌群、調節(jié)免疫功能等生理功效，是目前研究最為深入的乳酸菌之一[1,2]。發(fā)酵乳是活性益生菌的主要載體，研究顯示添加鼠李糖乳桿菌發(fā)酵的牛乳能夠產生抑菌、降血壓、抗突變等多種活性因子[3，4]。建立快速特異的鼠李糖乳桿菌計數方法對于評價發(fā)酵乳中有效活菌數、研究發(fā)酵和貯藏過程中活菌變化規(guī)律具有重要意義[5]。相比現有的益生菌計數方法[6-9]，菌落免疫印跡技術（Colony immunoblotting，CIB）更加快速、廉價，適合復雜生態(tài)體系中細菌的分離和計數[10，11]，但該法在鼠李糖乳桿菌選擇性計數方面國內外還沒有相關報道。菌毛蛋白（FimI）是高粘附性鼠李糖乳桿菌表面特有的標志物[12],本文應用重組FimI抗體（anti-rFimI）建立了鼠李糖乳桿菌CIB計數方法，并對長壽人群來源的鼠李糖乳桿菌grx19（CGMCC No.5519）[13]在多菌株發(fā)酵乳體系中的生長與存活特征進行研究，旨在為鼠李糖乳桿菌grx19發(fā)酵乳產品的質量控制提供新的檢測方法。

1 實驗

1.1 材料

鼠李糖乳桿菌grx19（Lactobacillus rhamnosus grx19，CGMCC No.5519）菌株；保加利亞乳桿菌LB（Lactobacillus bulgaricus，LB）和嗜熱鏈球菌ST（Streptococcus thermophilus，ST）均分離自商品化酸奶發(fā)酵劑；重組鼠李糖乳桿菌鞭毛亞基多克隆抗體（anti-rFimI）由本室制備；MRS培養(yǎng)基；PCR試劑、HRP標記的羊抗鼠IgG以及細菌16S rDNA擴增引物8F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 15R：5'-AAGGAG GTGATCCAGCCGCA-3'，其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 發(fā)酵劑的制備

將菌株grx19、LB和ST凍干菌粉接種5 mL MRS液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)36 h，取培養(yǎng)物以5%（V/V）接種量接種MRS液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，4℃離心收集菌體（4 000 g，10 min），用PBS緩沖液懸浮菌體，并調整OD600nm=0.5，菌株grx19、LB和ST按不同體積比混合，制備菌懸液Amix（0∶1∶1）、Bmix（0.01∶1∶1）、Cmix（0.1∶1∶1）、Dmix（1∶1∶1）、Emix（10∶1∶1），所制得的混合菌懸液置4℃保藏備用。

1.3 菌落免疫印跡

將單菌株及混合菌株懸液用PBS緩沖液梯度稀釋，選取3個適當的稀釋度進行MRS平板涂布，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后進行活菌計數，并選擇分離良好的平板用于菌落免疫印跡測定。剪取與培養(yǎng)皿內徑大小相同的硝酸纖維素（NC）膜，在去離子水中浸泡10 min，37℃干燥10 min。將NC膜置于培養(yǎng)基表面，使膜與培養(yǎng)基表面充分接觸，室溫靜置5 min后取下NC膜，37℃干燥30 min；將轉印膜放置在5%的脫脂乳中，室溫封閉1 h；PBST緩沖液洗滌3次，置于anti-rFimI抗體稀釋液中（稀釋度為1∶2000）室溫孵育1 h；PBST洗滌3次，置于HRP標記的羊抗鼠IgG（1∶1 000稀釋）中孵育1 h；PBST洗滌3次，將轉印膜浸入新鮮配制的DAB顯色液中，避光顯色10 min，待膜上出現明顯斑點，用去離子水漂洗2次終止反應，將膜置于干凈濾紙上自然干燥，分析陽性斑點對應的菌落及數量。

1.4 陽性菌落確證

挑取陽性斑點對應的菌落，接種MRS液體培養(yǎng)基，按文獻[14]所述的CTAB方法提取基因組DNA；以基因組DNA為模板進行16S rDNA擴增。PCR反應體系為：2 μL模板（50 ng/μL）、4 μL dNTPs（25 mmol/μL）、引物8F（10 pmol/μL）和15R（10 pmol/ μL）各1.5 μL、10×Buffer 5 μL、MgCl2（25 mmol/L）5 μL、Tag酶（5 U/ μL）0.3 μL、加ddH2O補足至50 μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35次循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產物委托上海生物工程有限公司測序，所得結果在基因庫GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中進行Blasten比對，序列同源性大于99%設為相同種。

1.5 發(fā)酵乳樣品制備

將12%的脫脂復原乳95℃殺菌5 min，冷卻至42℃，分成A、B、C、D 4個接種組，每組設置3個重復，LB和ST均按體積分數為1.0%接種；grx19分別按0%（A組），0.1%（B組），1%（C組）和10%（D組）接種；接種物于42℃培養(yǎng)9 h，在第0，3，6和9小時取樣測定grx19和LB+ST活菌數以及pH值。制備好的發(fā)酵乳樣品置4 ℃貯藏28 d，在第1，7，14，21 d和28 d取樣測定grx19及LB+ST活菌數。

1.6 pH測定

將發(fā)酵乳樣品溫度調節(jié)至20℃，采用數顯式pH計測量。

1.7 活菌數測定

總活菌數檢測按文獻[15]方法進行，將發(fā)酵乳樣品采用生理鹽水梯度稀釋，選取3個適當的稀釋度進行MRS平板涂布，37℃恒溫培養(yǎng)48 h后進行活菌計數；鼠李糖乳桿菌grx19活菌通過菌落免疫印跡法計數，試驗方法同1.3所述；LB+ST活菌數根據免疫印跡試驗中的陰性菌落數計算，取3次重復試驗的平均值表示活菌數（單位：mL-1）。

1.8 統(tǒng)計與分析

試驗結果取3次試驗的的平均值，組間差異采用Sigmaplot 10.0軟件中的t檢驗模式進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 鼠李糖乳桿菌grx19 CIB檢測方法建立

將菌株grx19、LB和ST的混合菌懸液，梯度稀釋后涂布MRS平板,厭氧培養(yǎng)48 h形成的菌落通過轉印和CIB處理后，grx19菌落在NC膜上形成清晰的菌落印跡，而LB和ST則不能形成印跡（如圖1所示）。16S rDNA測序鑒定結果證實所有陽性菌落（圖1中箭頭所示）均為鼠李糖乳桿菌（序列同源性大于99%），結果表明應用鼠李糖乳桿菌菌毛抗體anti-rFimI（稀釋度1∶2 000）作為檢測抗體，所建立的菌落免疫印跡法能夠特異性的檢測MRS分離平板上的鼠李糖乳桿菌菌落。

圖1 鼠李糖乳桿菌grx19菌落免疫印跡檢測方法的建立

2.2 混合菌懸液中鼠李糖乳桿菌grx19的CIB計數結果

以不同比例混合的grx19、LB和ST菌懸液作為模擬樣品，應用MRS平板分離結合CIB對其中的grx19以及LB+ST活菌進行計數，結果如表1所示。表中數據顯示grx19單菌株懸液形成的CIB菌落陽性率為100%，而LB、ST以及Amix等不含grx19的菌懸液形成的陽性菌落均為0，菌懸液Bmix、Cmix、Dmix和Emix中陽性菌落比例分別為0.5%，3.3%，35.1%和84.4%；與預設的grx19比例（0.6%，5.8%，38.1%和86.0%）基本一致（R2=0.998）。隨機挑取陽性菌落進行16S rDNA測序鑒定，結果100%為鼠李糖乳桿菌。結果表明所建立的計數方法能夠反應混合菌株樣品中的grx19的活菌數量變化。

表1 菌落免疫印跡法對不同菌懸液中grx19活菌數的測定結果

2.3 發(fā)酵過程中活菌數變化

應用MRS平板計數結合CIB方法對接種不同濃度grx19、LB和ST發(fā)酵乳中的活菌數進行檢測，結果如圖2所示。發(fā)酵過程中，LB+ST總活菌數均呈現快速上升趨勢，A、B、C、D四個接種組LB+ST活菌濃度分別由1.4×107mL-1上升到4.3×108～6.9×108mL-1，而grx19在B組（0.1%接種）中活菌數由0.7×106mL-1上升到3.6×106mL-1，D組（10%接種量）中的grx19活菌數由7×107mL-1上升到2.2×108mL-1，均顯示了較慢的生長速度。鼠李糖乳桿菌grx19的起始接種濃度對發(fā)酵乳中LB+ST增殖具有一定影響，A組和B組在4個取樣點LB+ST活菌數變化沒有顯著差異（P＞0.05），表明低接種量grx19（B組）對LB+ST生長沒有顯著影響；中等接種量grx19（C組）在發(fā)酵6 h對LB+ST增殖具有一定促進作用；在高接種量grx19（D組）中，在0～3 h顯示了促進效應，但在6 h后對LB+ST的增殖顯示了一定的抑制效應。

圖2 發(fā)酵過程中grx19和LB+ST活菌數變化

2.4 發(fā)酵過程中pH值的變化

在發(fā)酵過程中，不同接種組的pH值變化趨勢如圖3所示，由圖3可知發(fā)酵過程中乳的pH值呈不斷下降趨勢，不同接種物起始pH在6.3至6.5之間，發(fā)酵終點pH值在4.3至4.6之間，發(fā)酵3～6 h內pH值下降最為迅速，但接種組A、B、C、D之間的pH變化沒有顯著差異，結果表明接種grx19菌株后沒有顯著影響凝乳和產酸。

圖3 發(fā)酵過程中pH值變化

2.5 4℃冷藏過程中活菌數變化

應用MRS平板計數結合菌落免疫印跡方法對不同發(fā)酵乳在4℃冷藏過程中的活菌數進行測定。結果如圖4所示。由圖4可知，在整個冷藏期內，發(fā)酵乳LB+ST活菌濃度在冷藏7 d后均呈現顯著降低的趨勢。A（LB+ST）、B（LB+ST+0.1%grx19）、C（LB+ST+1%grx19）、D（LB+ST+10%grx19）四個接種組的LB+ST活菌數下降值分別為4.83×108，4.62×108，6.36×108和4.47×108mL-1，第28 d存活率分別為7.8%，16.3%，8.7%和7.2%；grx19活菌數在冷藏14 d后呈現顯著降低的趨勢，B、C、D接種組中grx19活菌下降值分別5.05×106，3.12×107，1.69×108mL-1，第28 d存活率分別為31.6%，30.2%，32.2%，顯著高于LB+ST存活率（P＜0.01），表明grx19耐低溫冷藏能力顯著高于LB和ST。

3 結論

（1）應用鼠李糖乳桿菌菌毛蛋白亞基FimI抗體建立的菌落免疫印跡方法，具有高度選擇性和特異性，方法簡便快速，能夠用于檢測多菌株發(fā)酵乳中鼠李糖乳桿菌的活菌動態(tài)變化，可為鼠李糖乳桿菌產品質量控制和活菌計數提供新方法。

圖4 4℃冷藏過程中grx19和LB+ST活菌數變化

（2）鼠李糖乳桿菌grx19（CGMCC No.5519）在發(fā)酵過程中增殖速度慢于常規(guī)發(fā)酵劑菌株，在發(fā)酵乳中添加（0.7-7）×106mL-1grx19，在發(fā)酵過程中對發(fā)酵劑菌株嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的生長和產酸影響不大，但高接種量的grx19（7×107mL-1）在發(fā)酵后期對發(fā)酵劑菌株生長有一定抑制效應。

（3）發(fā)酵乳中的鼠李糖乳桿菌grx19在4℃冷藏28 d后存活率保持在30%左右，耐低溫冷藏能力顯著高于常規(guī)發(fā)酵劑菌株LB和ST，表明該菌株可用于生產長貨架期的活菌型乳酸菌飲料及發(fā)酵乳制品。

[1]LEBEER S,CLAES I,TYTGAT H L P,et al.Functional analysis of Lactobacillus rhamnosus GG pili in relation to adhesion and immunomodulatory interactions with intestinal epithelial cells[J].Appl Environ Microbiol,2012,78：185-193.

[2]TUO Y,ZHANG W,ZHANG L,et al.Study of probiotic potential of four wild Lactobacillus rhamnosus strains[J].Anaerobe,2013,21：22-27.

[3]楊紅梅,林漢亮.鼠李糖乳桿菌在酸奶中的應用研究[J].新疆畜牧業(yè),2011,10：30-32.

[4]田豐偉,丁納,趙建新,等.鼠李糖乳桿菌YHOC137及其發(fā)酵乳的體外抗致突變作用[J].食品工業(yè)科技,2008,29（4）：71-74.

[5]TRIPATHI M K,GIRI S K.Probiotic functional foods：Survival of probiotics during processing and storage[J].J.Funct Foods,2014,9：225-24.

[6]包秋華，張家超，李梅花,等.一種快速定性和定量檢測發(fā)酵乳中L.rhamnosus的方法[J].乳業(yè)科學與技術,2010,5：225-227.

[7]ACHILLEOS C,BERTHIER F.Quantitative PCR for the specific quantification of Lactococcus lactis and Lactobacillus paracasei and its interest for Lactococcus lactis in cheese samples[J].Food Microbiol,2013,36：286-295.

[8]SAKAI T,OISHI K,ASAHARA T,et al.M-RTLV agar,a novel selective medium to distinguish Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei from Lactobacillus rhamnosus[J].Int J Food Microbiol,2010,139：154-160.

[9]LENA M D,QUERO G M,SANTOVITO E,et al.A selective medium for isolation and accurate enumeration of Lactobacillus casei-group lactobacilli in probiotic milks and dairy products[J].Int Dairy J,2015,47：27-36.

[10]DUEZ H,PELLETIER C,COOLS S,et al.A colony immunoblotting method for quantitative detection of a Bifidobacterium animalis probiotic strain in human faeces[J].J Appl Microbiol,2000,88：1019-1027.

[11]WIECKOWSKA-SZAKIEL M,BUBERT A,ROZALSKI M,et al.Colony-blot assay with anti-p60 antibodies as a method for quick identification of Listeria in food[J].Int J Food Microbiol,2002,72：63-71.

[12]REUNANEN J,VON OSSOWSKI I,HENDRIDKX A P A,et al.Characterization of the SpaCBA pilus fibers in the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG[J].Appl Environ Microbiol，2012，78：2337-2344.

[13]顧瑞霞，陳旭嬌，丁繆華，等.鼠李糖乳桿菌grx19及其應用[P].中國：ZL201110441666.7，2012-12-12.

[14]薩姆布魯克J，拉塞爾著D W.分子克隆實驗指南[M].3版.北京：科學出版社,2002：68-105.

[15]GB 4789.35—2010,食品安全國家標準：食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2010.