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    乳酸桿菌對(duì)感染大腸桿菌小鼠腸黏膜免疫的影響

    2015-12-16 07:44:04周晶周穎曹鳳波劉賓霍貴成
    中國(guó)乳品工業(yè) 2015年2期
    關(guān)鍵詞:乳酸桿菌干酪灌胃

    周晶,周穎,曹鳳波,劉賓,霍貴成

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱150030)

    0 引言

    大腸桿菌典型菌株O157:H7能夠引起溶血性尿毒癥、腹瀉及出血性腸炎等疾病,危害人類健康[1]。腸道粘膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體防御的重要防線,它能阻止病原微生物與腸上皮細(xì)胞的接觸并通過抗原的刺激激發(fā)機(jī)體相應(yīng)的免疫應(yīng)答。病原菌入侵機(jī)體后,非特異性免疫系統(tǒng)被激活,病原菌被吞噬細(xì)胞識(shí)別吞噬,溶酶體將病原菌降解,進(jìn)而激活T淋巴細(xì)胞等具有免疫功能的細(xì)胞,促使這些細(xì)胞分泌IL-2等細(xì)胞因子。細(xì)胞因子能夠參與機(jī)體免疫應(yīng)答,調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫和固有免疫應(yīng)答。sIgA是機(jī)體腸黏膜免疫系統(tǒng)重要的抗體之一,由sIgA參與的體液免疫是防御病原菌在腸黏膜定植的重要防線[2]。sIgA和細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度是研究腸道粘膜免疫反應(yīng)的重要參考指標(biāo)[3]。

    乳酸桿菌能刺激腸粘膜免疫系統(tǒng)分泌sIgA等抗體及IL-6等細(xì)胞因子,對(duì)于大腸桿菌引起的腹瀉起到預(yù)防和治療的作用[4]。副干酪乳桿菌LAFTI L26能夠促進(jìn)IL-2等細(xì)胞因子的分泌,提高機(jī)體的免疫力[5]。本研究以副干酪乳桿菌KLDS1.0351和植物乳桿菌KLDS1.0986為目標(biāo)益生菌,探究其對(duì)免疫的調(diào)節(jié)作用。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 材料與設(shè)備

    菌種:副干酪乳桿菌KLDS1.0351,植物乳桿菌KLDS1.0985和 KLDS1.0986。大腸桿菌 O157:H7(Escherichia coli O157:H7 ATCC 43889)。

    實(shí)驗(yàn)用小鼠:小鼠購(gòu)買自哈獸研六周齡,等級(jí)為清潔級(jí),體重約在20~25 g的雌性BALB/c小鼠;

    試劑盒:小鼠sIgA,白細(xì)胞介素(IL-2、IL-6),IFN-γ ELISA試劑盒。

    設(shè)備:高壓滅菌鍋HVE-50HIRAYAM,恒溫培養(yǎng)箱,Model680型酶標(biāo)儀,VD-1320潔凈工作臺(tái)。

    1.2 方法

    1.2.1 灌胃液的制備

    將穩(wěn)定期的副干酪乳桿菌、植物乳桿菌及大腸桿菌菌液6 000 rpm離心10 min,收集菌體無(wú)菌PBS洗滌兩次,棄去上清液,用PBS懸浮并調(diào)節(jié)菌濃度至108cfu/mL,4 ℃保存?zhèn)溆肹6-7]。

    1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組

    試驗(yàn)將小鼠分為四組(空白組;大腸桿菌對(duì)照組;副干酪乳桿菌組;植物乳桿菌組),每天12∶00進(jìn)行灌胃,灌胃體積為0.2 mL[8]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組如表1所示。分別在第1,3,5,7,9,11,13,15 d 9∶00(提前進(jìn)食)處死4組小鼠,每組3只,解剖取小腸組織。

    表1 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.2.3 小鼠外觀及生長(zhǎng)狀況觀察

    試驗(yàn)期間觀察小鼠的進(jìn)食、毛色、精神狀態(tài)、體重及糞便變化。

    1.2.4 sIgA的測(cè)定

    縱向剖開小腸,5 mL無(wú)菌的PBS沖洗小腸內(nèi)容物,在4℃、10 000×g條件下離心10 min,收集上清液分裝于離心管中,在-20℃下儲(chǔ)存,待樣品收集完后用sIgA ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定[9-10]。

    1.2.5 細(xì)胞因子的測(cè)定

    將小腸稱重后按PBS∶小腸=9∶1的比例加入無(wú)菌PBS,用組織勻漿器將小腸破碎后倒入離心管中,在4℃(8 000 r/min)條件下離心10 min收集上清液并分裝于離心管中,-20℃下儲(chǔ)存,待樣品收集完后用細(xì)胞因子ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定[11-12]。

    1.2.6 數(shù)據(jù)處理

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)根據(jù)SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel進(jìn)行相關(guān)性及方差分析并繪制圖標(biāo),以0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 灌胃期間小鼠外觀及體質(zhì)量的變化

    在灌胃期間觀察小鼠的外觀及體重變化。當(dāng)小鼠的食欲降低、出現(xiàn)腹瀉及毛色變得不柔順沒有光澤甚至出現(xiàn)掉毛現(xiàn)象時(shí)說明小鼠感染大腸桿菌模型建立成功。試驗(yàn)第4 d小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀,精神萎靡,進(jìn)食量減少,出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象,說明大腸桿菌感染模型建立成功。從第8d補(bǔ)充兩株乳酸桿菌后,小鼠的精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn),進(jìn)食量增加,腹瀉癥狀逐漸緩解。灌胃期間小鼠體質(zhì)量的變化如圖1所示。

    圖1 兩株乳酸桿菌對(duì)感染大腸桿菌O157:H7小鼠體質(zhì)量的影響

    由圖1可以看出,在1~14 d的灌胃中空白組小鼠的體質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定,在1~7 d灌胃大腸桿菌的小鼠體質(zhì)量呈下降的趨勢(shì),從第3天開始,灌胃大腸桿菌的三組小鼠體質(zhì)量與空白組差異顯著(P<0.05)。第8天對(duì)小鼠補(bǔ)充副干酪乳桿菌和植物乳桿菌后,從第9 d開始小鼠的體質(zhì)量有所上升,雖然體重仍低于空白組和致病前的初始體質(zhì)量,但與未補(bǔ)充大腸桿菌的對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。在灌胃兩株乳酸桿菌后,小鼠的體質(zhì)量有所增加,而對(duì)照組的小鼠體質(zhì)量仍繼續(xù)下降,這說明該兩株乳酸桿菌對(duì)大腸桿菌引起的小鼠體質(zhì)量減輕的癥狀能夠起到一定的緩解作用;當(dāng)在灌胃后的第15天對(duì)小鼠進(jìn)行稱量發(fā)現(xiàn)兩株乳酸菌組小鼠的體質(zhì)量之間并沒有顯著性差異,這說明兩株乳酸桿菌對(duì)大腸桿菌引起的小鼠體質(zhì)量減輕的緩解作用水平是相當(dāng)?shù)摹?/p>

    2.2 兩株菌株對(duì)感染小鼠腸黏膜免疫的影響

    2.2.1 對(duì)小鼠腸黏膜sIgA的影響

    sIgA對(duì)致病菌在腸道的定植起到抑制作用,能與微生物等抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物[13-14],對(duì)維持機(jī)體腸道健康有著重要意義。小鼠在1~14 d灌胃中sIgA的變化如圖2所示。

    圖2 兩株乳酸桿菌對(duì)小鼠腸黏膜sIgA質(zhì)量濃度的影響

    由圖2可知,空白組小鼠sIgA的質(zhì)量濃度相對(duì)穩(wěn)定;小鼠在感染大腸桿菌后sIgA的分泌量開始增加,并在第5 d達(dá)到最大值,從第7 d開始sIgA的分泌量減少,第11 d sIgA的質(zhì)量濃度低于空白組,從第13 d開始與空白組差異顯著(P<0.05);第8 d開始對(duì)小鼠分別補(bǔ)充副干酪乳桿菌和植物乳桿菌,從第9 d開始兩株乳酸菌組sIgA的質(zhì)量濃度上升,并且與空白組及對(duì)照組差異顯著(P<0.05),當(dāng)在第11 d達(dá)到最大值。兩株乳酸菌引起腸粘膜中sIgA的質(zhì)量濃度增加遠(yuǎn)高于大腸桿菌引起sIgA增加的最高水平。

    2.2.2 對(duì)小鼠腸黏膜IFN-γ的影響

    IFN-γ能夠抑制IgE的分泌進(jìn)而抑制由IgE引起的I型超敏反應(yīng)[15],IFN-γ還可以激活NK細(xì)胞,是機(jī)體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要細(xì)胞因子。小鼠在1~14 d灌胃中IFN-γ的變化如圖3所示。

    圖3 兩株乳酸桿菌對(duì)小鼠腸黏膜IFN-γ的影響

    由圖3可以看出,空白組小鼠IFN-γ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)穩(wěn)定,小鼠感染大腸桿菌后IFN-γ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,在第3 d達(dá)到最大值,之后降低,從第7 d開始低于對(duì)照組,在第15 d與空白組差異顯著(P<0.05);在第8 d補(bǔ)充兩株乳酸桿菌后,IFN-γ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,與空白組和對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。其中副干酪乳桿菌在第11 d達(dá)到最大值,之后下降,植物乳桿菌在第9 d達(dá)到最大值,之后開始下降。兩株乳酸桿菌引起的IFN-γ的增加遠(yuǎn)高于小鼠感染大腸桿菌引起的IFN-γ增加的最大值。

    2.2.3 對(duì)小鼠腸黏膜IL-2的影響

    IL-2是由T細(xì)胞合成的,能夠降低炎癥作用,對(duì)由感染致病菌引起的免疫抑制起到一定的緩解作用[16]。小鼠在1~14 d灌胃中IL-2的變化如圖4所示。

    圖4 兩株乳酸桿菌對(duì)小鼠腸黏膜IL-2的影響

    由圖4可以看出,空白組小鼠IL-2質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較為穩(wěn)定;對(duì)照組小鼠在灌胃大腸桿菌后IL-2質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,在第3天達(dá)到最大值,之后開始下降,第9天與空白組差異顯著(P<0.05);第8天補(bǔ)充兩株乳酸桿菌后,IL-2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第9天開始增加,副干酪乳桿菌在第11天達(dá)到最大值,植物乳桿菌在第13天達(dá)到最大值;兩株乳酸桿菌組IL-2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于空白組和對(duì)照組(P<0.05),在第15天時(shí)仍然與對(duì)照組和空白組差異顯著(P<0.05)。

    2.2.4 對(duì)小鼠腸粘膜IL-6的影響

    IL-6能夠參與NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞活化,還能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。小鼠在1~14 d灌胃中IL-6的變化如圖5所示。

    圖5 兩株乳酸桿菌對(duì)小鼠腸黏膜IL-6的影響

    由圖5右以看出,空白組IL-6質(zhì)量分?jǐn)?shù)較為穩(wěn)定;灌胃大腸桿菌后,IL-6的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加并在第5天達(dá)到最大值,之后開始下降,從第9天開始小于對(duì)照組;在第8天對(duì)小鼠補(bǔ)充副干酪乳桿菌和植物乳桿菌后,IL-6的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加,并與對(duì)照組及空白組差異顯著(P<0.05);植物乳桿菌和副干酪乳桿菌分別在第9天和第11天達(dá)到最大值,之后雖然有所下降,但均與對(duì)照組及空白組差異顯著(P<0.05),且高于大腸桿菌引起的最大值。

    2.3 討論

    對(duì)感染大腸桿菌的小鼠分別補(bǔ)充副干酪乳桿菌和植物乳桿菌后,小鼠的體質(zhì)量有所上升,但仍較空白組低,說明乳酸桿菌對(duì)大腸桿菌引起的小鼠體重減輕有一定的延時(shí)性,如果長(zhǎng)期服用效果可能會(huì)更好。小鼠在感染大腸桿菌初期sIgA及細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度上升,之后下降,這可能是由于大腸桿菌入侵后會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng),但隨著大腸桿菌的不斷入侵,小鼠腸黏膜免疫遭到破壞,抑制了細(xì)胞因子的分泌。補(bǔ)充兩株乳酸桿菌后,sIgA及三種細(xì)胞因子的分泌量顯著提高且都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大腸桿菌引起的最大分泌量,由此我們猜測(cè)細(xì)胞因子及sIgA的分泌量是導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)照組與兩株乳酸桿菌組小鼠機(jī)體免疫反應(yīng)差異的主要原因,乳酸桿菌可以調(diào)節(jié)腸粘膜中的細(xì)胞因子及sIgA的質(zhì)量濃度進(jìn)而對(duì)免疫機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié),對(duì)機(jī)體感染大腸桿菌起到治療的作用,這與相關(guān)研究也是吻合的[17]。

    3 結(jié)論

    副干酪乳桿菌KLDS1.0351和植物乳桿菌KLDS1.0986能對(duì)大腸桿菌感染引起的腹瀉和體重減輕起到緩解的作用,兩株菌株能顯著促進(jìn)感染大腸桿菌小鼠腸粘膜中IFN-γ,IL-2,IL-6及腸道中sIgA的分泌,并遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大腸桿菌刺激的最大值。

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