OPN在肺鱗癌組織中高表達(dá)及其臨床意義

何 嶸，劉永煜

遼寧省腫瘤醫(yī)院胸外科，遼寧 沈陽 110042

OPN在肺鱗癌組織中高表達(dá)及其臨床意義

何 嶸，劉永煜

遼寧省腫瘤醫(yī)院胸外科，遼寧 沈陽 110042

背景與目的：骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種分泌型磷酸化糖蛋白，在多種腫瘤組織中異常高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有密切關(guān)系。當(dāng)腫瘤細(xì)胞侵襲細(xì)胞外基質(zhì)時(shí)，OPN可通過NF-κB依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metal protease，MMPs)，引起細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移。該研究通過檢測(cè)肺鱗狀上皮細(xì)胞癌(lung squamous cell carcinoma，SCC)患者腫瘤組織中OPN的蛋白水平，研究其與各臨床指標(biāo)的關(guān)系及其意義。方法：采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)265例石蠟包埋的肺SCC組織和24例正常肺組織中OPN蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：OPN在肺SCC組織表達(dá)陽性率為64.5%，顯著高于正常肺組織(陽性率為29.2%，P＜0.001)。OPN在肺SCC晚期(Ⅲ+Ⅳ期)表達(dá)陽性率為78.4%，顯著高于早期(Ⅰ+Ⅱ期)組織(陽性率為54.5%，P＜0.001)。在T3～4分期的肺SCC組織中OPN表達(dá)陽性率為76.9%，顯著高于T1～2分期(59.4%，P=0.007)。OPN的表達(dá)與肺SCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中表達(dá)陽性率為73.4%，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織(陽性率為51.4%，P＜0.001)。結(jié)論：OPN參與肺SCC的發(fā)生、發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示其在肺SCC的診斷、判斷預(yù)后及治療方面具有重要參考價(jià)值。

骨橋蛋白；肺鱗狀上皮細(xì)胞癌；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

骨橋蛋白(osteopontin，OPN)在多種正常組織和細(xì)胞中表達(dá)，包括骨骼、腎臟、血管、活化的巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等，是一種分泌型鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白。人OPN基因位于4q13，包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，相對(duì)分子質(zhì)量約為44×103［1］。OPN蛋白含有一個(gè)精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGU)的特殊結(jié)構(gòu)序列，此序列與細(xì)胞黏附功能相關(guān)［2］。OPN含有凝血酶作用位點(diǎn)，它可被凝血酶分解暴露出隱秘的C末端以及整合素結(jié)合基序，從而可以與細(xì)胞外基質(zhì)中整合素CD44v6、41、91結(jié)合，參與腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移［3］。目前，已有大量研究表明它在多種實(shí)體瘤中異常高表達(dá)，并與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4］。

近年來隨著城市工業(yè)化的進(jìn)展，肺癌已經(jīng)成為我國第一大癌癥，其發(fā)病率和死亡率均位于各種腫瘤首位。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是威脅肺癌患者生存的主要因素，5年生存率僅約為15%［5］。肺鱗狀上皮細(xì)胞癌(lung squamous cell carcinoma，SCC)是非小細(xì)胞肺癌的主要病理類型，本研究使用免疫組織化學(xué)染色的方法、大樣本分析肺SCC組織中OPN的蛋白水平及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象及組織樣本

所有臨床組織樣本取自2009年11月—2012年7月遼寧省腫瘤醫(yī)院胸部外科收治的肺癌患者。所有患者手術(shù)前均未接受過放射治療或化學(xué)藥物治療。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)2004年的肺癌組織學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺癌組織學(xué)分型，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(International Union Against Cancer，UICC)2002年發(fā)布的第6版肺癌TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行肺癌分期。265例樣本采用10%甲醛固定，石蠟包埋肺SCC組織用于免疫組織化學(xué)染色?；颊吣行?30例，女性35例，中位年齡60歲(31～81歲)；Ⅰ+Ⅱ期154例，Ⅲ+Ⅳ期111例；低分化125例，中高分化140例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移158例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移117例。另取癌組織旁的24例正常肺組織作為對(duì)照。具體臨床資料信息見表1。

表 1 肺SCC組織中OPN蛋白的表達(dá)情況Tab. 1 Expression of OPN in tissue samples from SCC patients [n(%)]

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

采用免疫組織化學(xué)SP法，鼠源OPN抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，稀釋度為1∶100。免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自北京中

杉金橋生物科技有限公司。染色操作程序參照試劑說明書進(jìn)行。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

由2位病理科醫(yī)師顯微鏡下獨(dú)立觀察染色情況。OPN蛋白在細(xì)胞質(zhì)著色，染色強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)為：無染色0分，輕度染色(淺黃色)1分，中度染色(棕黃色)2分，強(qiáng)染色(黃褐色)3分；染色面積判斷標(biāo)準(zhǔn)為：無細(xì)胞染色0分，＜25%細(xì)胞染色1分，25%～50%細(xì)胞染色2分，＞50%細(xì)胞染色3分。2種積分相乘，按照0分為“-”， 1～2為“+”， 3～4為“++”， 6～9為“+++”的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行半定量判斷，≥“++”為陽性，“-、+”為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件(SPSS INC，IL，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney U檢驗(yàn)來比較免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的組間差異。所有比較均為雙側(cè)的，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 OPN蛋白在肺癌組織中的表達(dá)顯著升高

OPN蛋白的免疫組化染色顯示主要為細(xì)胞質(zhì)著色。OPN在SCC組織陽性表達(dá)率為64.5%(171/265，圖1A)，正常肺組織的陽性表達(dá)率為29.2%(7/24，圖1B，表1)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。OPN在≤60歲的肺癌患者中表達(dá)陽性率顯著高于＞60歲者的陽性率(72.0% vs 58.5%，P=0.022)。而OPN的表達(dá)與肺SCC患者的性別、吸煙史和家族史無相關(guān)性(P＞0.05)。

圖 1 利用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)OPN在肺SCC細(xì)胞中的表達(dá)Fig. 1 Detection of OPN expression in lung squamous cell carcinoma by immunohistochemistry

2.2 OPN蛋白在肺癌組織中的表達(dá)與肺SCC臨床病理特征的關(guān)系

OPN在SCC晚期(Ⅲ+Ⅳ期)表達(dá)陽性率為78.4%(87/111)顯著高于早期(Ⅰ+Ⅱ期)組織中的陽性率(54.5% 84/154，P＜0.001)。在T3～4分期的肺SCC組織中OPN表達(dá)陽性率為76.9%(60/78)，顯著高于T1～2分期(59.4%，111/187，P=0.007)。OPN的表達(dá)與SCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中表達(dá)陽性率為73.4%(116/158)，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織(陽性率為51.4%，55/107，P＜0.001)。在低、中、高分化的肺癌組織中TIMP2的陽性率分別為62.4%(78/125)和66.4%(93/140)，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.495)。

3 討 論

惡性腫瘤的一個(gè)重要特征是浸潤和轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞通過降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，在這

種降解過程中發(fā)揮重要作用的是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metal protease，MMPs)［6］。當(dāng)腫瘤細(xì)胞侵襲細(xì)胞外基質(zhì)時(shí)，OPN可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MMPs，引起細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移［4］。Gao等［7］研究顯示OPN與其受體CD44v6和αvβ3結(jié)合后也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移。

在本研究中，OPN表達(dá)與肺SCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺SCC組織OPN表達(dá)的陽性率顯著升高。而經(jīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移往往是肺癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要途徑，預(yù)示了患者的不良預(yù)后。Sun等［8］研究非小細(xì)胞肺癌組織中OPN和CD44v6的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)兩者的聯(lián)合檢測(cè)是腫瘤復(fù)發(fā)和生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。此外，Chen等［9］針對(duì)OPN基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌生存率及發(fā)生骨轉(zhuǎn)移概率關(guān)系的研究，指出OPN-443C/T是潛在的判斷肺癌患者預(yù)后及預(yù)測(cè)其是否發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。喻鈞等［10］采用免疫組織化學(xué)方法研究顯示OPN在肺癌組織中顯著高于在正常肺組織中的表達(dá)水平，并且與肺癌的組織學(xué)類型有關(guān)，在肺SCC組織中(陽性率為82.9%，29/35)表達(dá)明顯高于肺腺癌(陽性率為29.4%，10/34)，但是樣本量較小。在本研究中，通過大樣本(265例)檢測(cè)肺SCC組織中OPN的表達(dá)情況，陽性表達(dá)率為64.5%。

本研究中，晚期SCC患者腫瘤組織中表達(dá)量顯著升高(P＜0.001)，并與患者的T分期顯著呈正相關(guān)(P=0.007)。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。Rud等［11］研究表明，OPN在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)水平與腫瘤臨床分期及腫瘤大小有關(guān)，并且腫瘤組織中OPN陽性表達(dá)的患者血漿中OPN的蛋白水平高于腫瘤組織中OPN陰性表達(dá)的患者。Likui等［12］研究結(jié)果顯示，OPN mRNA的表達(dá)水平與腫瘤的TNM分期及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，OPN mRNA高表達(dá)的結(jié)腸癌患者的無病生存期及總生存期都較OPN mRNA低表達(dá)的結(jié)腸癌患者短，提示OPN可作為判斷結(jié)腸癌預(yù)后的獨(dú)立因素。這些結(jié)果提示OPN在促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。

OPN在其他腫瘤中的表達(dá)情況。Nabih等［13］研究結(jié)果顯示，檢測(cè)OPN在丙肝感染的肝癌患者血漿中的蛋白水平可以提高肝癌患者的診斷率和預(yù)后判斷。此外，Zhu等［14］針對(duì)374例肝癌患者的研究表明，腫瘤OPN的表達(dá)水平聯(lián)合微環(huán)境相關(guān)的瘤周巨噬細(xì)胞(peritumoral macrophages，PTMs)浸潤程度，對(duì)于判斷肝癌患者尤其是早期病變患者的復(fù)發(fā)具有意義。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可促進(jìn)癌細(xì)胞的血行播散尤其是肝臟轉(zhuǎn)移。Imano等［15］研究表明，在結(jié)腸直腸癌的中央?yún)^(qū)域的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生OPN，促進(jìn)腫瘤新血管形成，導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移，故OPN也可能成為潛在的抗腫瘤血管形成的作用位點(diǎn)。此外，多項(xiàng)研究顯示，OPN在卵巢癌細(xì)胞中呈異常高表達(dá)［16-17］。

最近大量研究表明，OPN在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，在腫瘤組織中的異常高表達(dá)及與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的明顯關(guān)系，使它可以成為診斷惡性腫瘤及判斷預(yù)后的潛在標(biāo)志物。本研究中，通過檢測(cè)OPN在大樣本肺SCC組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈顯著正相關(guān)，提示其可能作為SCC預(yù)后的標(biāo)志物以及潛在治療靶點(diǎn)。

［1］ OLDBERG A, FRANZEN A, HEINEGARD D. Cloning and sequence analysis of rat bone sialoprotein (osteopontin) cDNA reveals an Arg-Gly-Asp cell-binding sequence ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 1986, 83(23)： 8819-8823.

［2］ PRINCE C W, OOSAWA T, BUTLER W T, et al. Isolation, characterization, and biosynthesis of a phosphorylated glycoprotein from rat bone ［J］. J Biol Chem, 1987, 262(6)：2900-2907.

［3］ SHARIF S A, DUX, MYLES T, et al. Thrombin-activatable carboxypeptidase B cleavage of osteopontin regulates neutrophil survival and synoviocyte binding in rheumatoid arthritis ［J］. Arthritis Rheum, 2009, 60(10)： 2902-2912.

［4］ WAI P Y, KUO P C. The role of osteopontin in tumor metastasis ［J］. J Surg Res, 2004, 121(2)： 228-241.

［5］ CHEN W, ZHENG R, ZHANG S, et al. Annual report on status of cancer in China, 2010 ［J］. Chin J Cancer Res, 2014, 26(1)： 48-58.

［6］ STETLER-STEVENSON W G, LIOTTA L A, KLEINER D E Jr. Extracellular matrix 6： role of matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis ［J］. FASEB J, 1993, 7(15)：1434-1441.

［7］ GAO C, GUO H, DOWNEY L, et al. Osteopontin-dependent

CD44v6 expression and cell adhesion in HepG2 cells ［J］. Carcinogenesis, 2003, 24(12)： 1871-1878.

［8］ SUN B S, LI Y, ZHANG Z F, et al. Osteopontin combined with CD44v6, a novel prognostic biomarker in non-small cell lung cancer undergoing curative resection ［J］. Ann Thorac Surg, 2013, 96(6)： 1943-1951.

［9］ CHEN Y, LIU H, WU W, et al. Osteopontin genetic variants are associated with overall survival in advanced non-smallcell lung cancer patients and bone metastasis ［J］. J Exp Clin Cancer Res, 2013, 32： 45.

［10］ 喻 鈞, 潘鐵成, 李 軍, 等. OPN、CD44v6及MMP-2在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)及臨床意義 ［J］. 中國肺癌雜志, 2006, 11(4)： 325-328.

［11］ RUD A K, BOYE K, OIJORDSBAKKEN M, et al. Osteopontin is a prognostic biomarker in non-small cell lung cancer ［J］. BMC Cancer, 2013, 13： 540.

［12］ LIKUI W, HONG W, SHUWEN Z. Clinical significance of the upregulated osteopontin mRNA expression in human colorectal cancer［J］. J Gastrointest Surg, 2010, 14(1)： 74-81.

［13］ NABIH M I, AREF W M, FATHY M M. Significance of plasma osteopontin in diagnosis of hepatitis C virus-related hepatocellular carcinoma ［J］. Arab J Gastroenterol, 2014, 15(3-4)： 103-107.

［14］ ZHU W, GUO L, ZHANG B, et al. Combination of osteopontin with peritumoral infiltrating macrophages is associated with poor prognosis of early-stage hepatocellular carcinoma after curative resection ［J］. Ann Surg Oncol, 2014, 21(4)： 1304-1313.

［15］ IMANO M, OKUNO K, ITOH T, et al. Increased osteopontinpositive macrophage expression in colorectal cancer stroma with synchronous liver metastasis ［J］. World J Surg, 2010, 34(8)： 1930-1936.

［16］ SONG G, CAI Q F, MAO Y B, et al. Osteopontin promotes ovarian cancer progression and cell survival and increases HIF-1alpha expression through the PI3-K/Akt pathway ［J］. Cancer Sci, 2008, 99(10)： 1901-1907.

［17］ MOSZYNSKI R, SZUBERT S, SZPUREK D, et al. Role of osteopontin in differential diagnosis of ovarian tumors ［J］. J Obstet Gynaecol Res, 2013, 39(11)： 1518-1525.

Expression of OPN protein in lung squamous cell carcinoma tissue and its clinical significance

HE Rong, LIU Yongyu (Department of Thoracic Surgery, Liaoning Cancer Hospital and Institute, Shenyang 110042, Liaoning, China)

LIU Yongyu E-mail: profyongyuliu@163.com

Background and purpose: Osteopontin (OPN) is a secreted glyco-phosphoprotein, which is overexpressed by numerous human cancers, invovled in tumor occurrence, development and prognosis. OPN up-regulates matrix metal proteases (MMPs) expression in a NF-κB-dependent fashion during extracellular matrix (ECM) invasion causing degradation of cell basement membrane and ECM leading to tumor invasion and metastasis. The aim of this study was to examine the protein level of OPN in a large number of tissue samples from patients with lung squamous cell carcinoma (SCC), and evaluate its potential clinical value. Methods: The OPN protein levels in 265 tumor tissue samples and corresponding 24 normal lung tissue samples were examined by immunohistochemical (IHC) analysis. Results: IHC results showed that the positive rate of OPN was 64.5% in the SCC tissues, which was significantly higher than that in normal alveoli tissues (29.2%, P＜0.001). The positive rate of OPN expression in late stage (Ⅲ+Ⅳ) tissues was 78.4%, significantly higher than that in early stage (Ⅰ+Ⅱ) tissue(positive rate 54.5%, P＜0.001). The positive rate of OPN expression in T3-4stage (Ⅲ+Ⅳ) tissue was 76.9%, significantly higher than that in T1-2stage tissue (positive rate 59.4%, P=0.007). The expression of OPN was signifcantly correlated with the status of lymph node metastasis (LNM). The positive rate in the tumor tissue with LNM was 73.4%, significantly higher than that without (positive rate 51.4%, P＜0.001). Conclusion: The level of OPN protein was overexpressed in lung cancer tissues, involved in SCC carcinogenesis and LNM. It is indicated that OPN has an important reference value in diagnosis, prognosis and therapy of SCC.

Osteopontin; Lung squamous cell carcinoma; Lymph node metastasis

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.10.010

R734.2

A

1007-3639(2015)10-0812-05

2014-11-05

2015-05-21）

劉永煜 E-mail:profyongyuliu@163.com