冷刺激對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43的影響及藥物干預(yù)的研究

黃強(qiáng)輝，洪葵，程曉曙，胡建新

冷刺激對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43的影響及藥物干預(yù)的研究

黃強(qiáng)輝，洪葵，程曉曙，胡建新

目的： 在急性冷刺激乳鼠心肌細(xì)胞模型下，評(píng)價(jià)縫隙連接蛋白43（Connexin43,Cx43）的表達(dá)及研究急性冷刺激時(shí)乳鼠心肌細(xì)胞間傳導(dǎo)的變化及其機(jī)制。

方法: 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)4℃組；實(shí)驗(yàn)0℃組；并在實(shí)驗(yàn)4℃組和實(shí)驗(yàn)0℃組分別加入100 nmol/L 抗心律失常肽（APP）10，每組乳鼠8只。采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析各組細(xì)胞的凋亡率，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)Cx43及其磷酸化水平在基因和蛋白上的表達(dá)。

結(jié)果: FCM結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)4℃組和實(shí)驗(yàn)0℃組隨著冷刺激程度加強(qiáng)和低溫時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞的凋亡率增加；同時(shí)PCR結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)4℃組和實(shí)驗(yàn)0℃組Cx43 mRNA呈現(xiàn)不同程度的下降；Western blot結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)4℃組和實(shí)驗(yàn)0℃組隨著刺激強(qiáng)度和低溫時(shí)間的延長(zhǎng)，Cx43蛋白表達(dá)亦出現(xiàn)不同程度的下降；磷酸化的Cx43(P-Cx43)蛋白表達(dá)亦下降，而AAP10干預(yù)后可提高兩組Cx43和P-Cx43蛋白的表達(dá)。

結(jié)論: 心肌細(xì)胞在急性冷刺激時(shí)Cx43在基因和蛋白水平上表達(dá)均有不同程度的下降，P-Cx43表達(dá)亦下降，而AAP10能提高Cx43和P-Cx43蛋白的表達(dá)從而改善細(xì)胞間的傳導(dǎo)。

冷刺激；心肌細(xì)胞；縫隙連接蛋白43； 磷酸化；抗心律失常肽

Methods: The primary neonatal rats’ myocardial cell culture was conducted in 4 groups. Group①, the cells were normally cultured, Group②, the cells were cultured at 4℃, Group③, the cells were cultured at 0℃ and Group④, the antiarrhythmia peptide (AAP 10) was added in Group② and Group③. The apoptosis rate of myocardial cells was evaluated by flow cytometry assay, mRNA and protein expressions of CX43 were examined by RT-PCR and Western blot analysis, and CX43 phosphorylation product (P-CX43) was detected.

Results: Compared with normally cultured cells, the myocardial cell apoptosis rate was obviously increased by acute cold stress at 4℃and 0℃with time extension. The mRNA expression of Cx43 was decreased at varying degrees at 4℃and 0℃stimulation, the protein expression of Cx43 was decreased at varying degrees at 4℃and 0℃ stimulation with time extension, and P-Cx43 level was decreased. While the APP 10 intervention may obviously elevate the protein levels of Cx43 and P-Cx43.

Conclusion: Acute cold stress could reduce the protein expression of CX43 and P-CX43, while APP 10 intervention may elevate such expression and improve the cell to cell conduction in neonatal rats’ myocardial cells.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:59.)

隨著人類對(duì)環(huán)保問(wèn)題認(rèn)識(shí)逐漸加深，氣候多變成為當(dāng)今世界的熱門(mén)話題之一，而突如其來(lái)的天氣變化如大雪和冰凍災(zāi)害等極端災(zāi)害天氣對(duì)人類健康帶來(lái)極大影響，使各種疾病的發(fā)病率急劇升高，尤其對(duì)心血管疾病的影響。寒冷刺激產(chǎn)生的應(yīng)激現(xiàn)象對(duì)心血管系統(tǒng)的損傷受到廣泛關(guān)注[1]。在急性冷應(yīng)激時(shí)對(duì)心血管系統(tǒng)的影響機(jī)制尚不明確。有報(bào)道示冷應(yīng)激反應(yīng)可致體內(nèi)兒茶酚胺物質(zhì)分泌增加，血壓升高，心率加快，心肌缺血等并由此引發(fā)的一系列病理生理改變[2]，而在許多心臟疾患中，縫隙連接蛋白的分布和功能的改變均可能影響心臟正常的電傳導(dǎo)[3]。在人類心肌組織中，心室肌主要以縫隙連接蛋白43（Connexin，Cx43）為主[4]；同時(shí)縫隙連接亦受多種因素的調(diào)控，如pH值、游離鈣離子濃度、神經(jīng)體液因素、生長(zhǎng)因子以及磷酸化狀態(tài)等，其磷酸化狀態(tài)的改變可影響通道的門(mén)控和縫隙連接蛋白的更新和轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響縫隙連接細(xì)胞間傳導(dǎo)通訊功能[5]。

抗心律失常肽（AAP）10是一種小分子多肽，它能促進(jìn)細(xì)胞間物質(zhì)交換，增強(qiáng)心肌細(xì)胞間的電傳導(dǎo)[6]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)急性冷應(yīng)激下對(duì)Cx43影響的研究甚少，具體機(jī)制不清楚；本實(shí)驗(yàn)擬探討寒冷刺激對(duì)Cx43的影響，為揭示冷應(yīng)激對(duì)心血管疾病的影響奠定生物學(xué)機(jī)制基礎(chǔ)。

1 材料與方法

動(dòng)物與試劑：2011-08至2012-05采用剛出生1～3天的乳鼠若干只（由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房及生理實(shí)驗(yàn)室提供），雌雄不限。AAP10（Gly-Aia-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH2）杭州中肽生化有限公司。使用的試劑包括：磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（主要成分：Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl ），DMEM高糖培養(yǎng)基和胰蛋白酶；膠原酶Ⅱ和胎牛血清（北京綠源博得生物科技公司），逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司），凋亡試劑盒（深圳紐邦生物）；連接蛋白43多克隆抗體（美國(guó)ADI公司）、小鼠抗β-actin單克隆抗體（美國(guó)Chemicon公司）；辣根過(guò)氧化物酶羊抗小鼠IgG抗體及小鼠抗磷酸化的Cx43（P-Cx43）單克隆抗體（美國(guó)SantaCruz公司）等。

心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及冷應(yīng)激模型的建立：①乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)：在消毒好的超凈臺(tái)上，將乳鼠（剛出生1～3天）第3、4肋間剪開(kāi)皮膚逐層，取出完整心臟，放入裝有PBS的培養(yǎng)皿中，分離筋膜和脂肪組織，洗凈血漬。然后將心臟組織剪碎成1 mm×1 mm×1 mm的小塊碎片。向其中加入5 ml 0.08%胰蛋白酶，吹打后用移液管把液體移入錐形瓶中，置37℃水浴箱中，搖動(dòng)消化5～6 min，取出錐形瓶，吸棄上清液，此步驟重復(fù)3次后觀察心肌組織較粘稠，再往錐形瓶中加入9 ml無(wú)血清DMEM+1ml膠原酶Ⅱ放入CO2孵箱中孵育，每隔20 min搖動(dòng)1次，視消化情況時(shí)間一般為1～3 h。再將消化好的錐形瓶?jī)?nèi)液體取出后加入與之等體積的15%胎牛血清DMEM10 ml，將上述20 ml液體分裝成4個(gè)離心管中，每個(gè)5 ml進(jìn)行離心，1000 r/min，每次5 min。離心后，吸棄上清液，加入5 ml培養(yǎng)基，再離心，重復(fù)2次。離心好后，棄上清，先加入5 ml培養(yǎng)基吹打混勻數(shù)十次，再加5 ml培養(yǎng)基至10 ml，取出濾器將4個(gè)離心管中的液體濾出至一個(gè)大的培養(yǎng)皿中，放置CO2孵箱中進(jìn)行貼壁2 h。最后取出，在顯微鏡下對(duì)心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)，并接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。每天顯微鏡下觀察并換液。培養(yǎng)至第4～5天時(shí)，可見(jiàn)細(xì)胞呈簇狀生長(zhǎng)，聚集成群，細(xì)胞活躍且搏動(dòng)有力。②實(shí)驗(yàn)分組及冷應(yīng)激模型的建立：將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分成3個(gè)組：正常對(duì)照組（常規(guī)培養(yǎng)），實(shí)驗(yàn)4℃組（冷刺激時(shí)間為4℃1 h、3 h和6 h）、實(shí)驗(yàn)0℃組（冷刺激時(shí)間為0℃10min、30 min和60 min），每組8只。冷應(yīng)激模型的建立：選培養(yǎng)至5～6 d的心肌細(xì)胞，用含-25℃、95%乙醇的恒溫低溫浴槽分別將細(xì)胞凍至4℃1h、3h和6h；0℃10min、30 min和60min，然后立即于37℃水浴復(fù)溫至接近37℃，置培養(yǎng)箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)6h，建立冷應(yīng)激模型[6]。

細(xì)胞凋亡率的測(cè)定：將正常對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)4℃組和實(shí)驗(yàn)0℃組的心肌細(xì)胞分別用0.25%胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察消化情況，待消化好后加入DEME血清中和并吹打數(shù)次，然后以2000 r/min離心10 min，棄上清，加PBS吹打混勻，離心3次。最后加Binding buffer吹打沉淀細(xì)胞，移入5 ml離心管中，分別加Annexin V-FITC和Propidium Iodide（PI）5 μl混勻后置4℃避光30min，用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)，在激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，檢測(cè)發(fā)射光波長(zhǎng)540 nm處紅色熒光，計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)Cx43 mRNA的表達(dá)：提取RNA：在消毒好的超凈臺(tái)上操作，上述各組細(xì)胞分別加入Trizo 1ml，轉(zhuǎn)入EP管中，室溫放置5 min后，4℃ 12 000 r/min，離心5 min，棄沉淀；

再加入200 μl氯仿，震蕩混勻，室溫放置15 min后，4℃ 12 000 r/min 離心15 min吸取上層水相至另一EP管中，加入0.5 ml異丙醇混勻，室溫放置110 min后，再次離心10 min，棄上清，RNA沉于管底。加入1 ml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀，4℃ 7 500 r/min離心10 min，盡量棄上清，室溫晾干10 min，20 μl焦碳酸二乙酯 （DEPC）水溶解RNA樣品，定量RNA濃度，取5 μl RNA樣品+逆轉(zhuǎn)錄酶+Cx43 mRNA引物（5’-GCTGGTGGTGTCCTTGGT-3’，5’-TTGGCATTCTGGTTGTCG-3’）或內(nèi)參3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）組成25 μl體系， 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增合成cDNA，反應(yīng)退火溫度52℃，并制膠跑電泳，最后在凝膠成像下觀察。

蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)Cx43和P-Cx43蛋白表達(dá)：各組細(xì)胞經(jīng)上述干預(yù)后，經(jīng)消化、離心后收集細(xì)胞，加用RIPA裂解液1ml先裂解細(xì)胞，放置4℃、10 min后，再加入蛋白提取液0.5 ml均勻搖蕩，放置4℃、3 min后，將各組細(xì)胞蛋白分別放置已沸騰的熱水中煮5 min。制作10%的分離膠和5%的積層膠， 10 μl蛋白+5 μl緩沖液上樣至每泳道，MARK 5 μ跑電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 （NC）膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉3次，每次約10 min，然后TBST [主要成分：8.8 g NaCl、20 ml Tric-Hcl（PH8.0）、0.5 ml Tween加入800 ml去離子水中搖勻]洗膜3次，每次10 min，洗畢后加入Cx43蛋白一抗（1：200）、抗P-Cx43蛋白（1：500）一抗和抗β-actin一抗（1：200）4℃封閉過(guò)夜，TBST溶液洗膜3次，每次10～15 min，室溫下加相應(yīng)二抗（1：5 000）孵育3 h，同前法洗膜3次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行抗原抗體顯色，X線曝光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)成像分析，將正常對(duì)照組灰度值設(shè)為1，其它組灰度值為與正常對(duì)照組比較得出的數(shù)據(jù)，并以內(nèi)參β-actin進(jìn)行對(duì)比標(biāo)化。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析方法用多因素方差分析，采用SPSS 17.0軟件分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

三組心肌細(xì)胞的形態(tài)變化：原代心肌細(xì)胞種板4 h后，在倒置顯微鏡下可觀察到心肌細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，初細(xì)胞形態(tài)為圓形，后為梭形。第1天細(xì)胞可視心肌細(xì)胞伸出較短的偽足，偶爾可見(jiàn)有單個(gè)搏動(dòng)的心肌細(xì)胞，搏動(dòng)頻率較慢，大約為20次/分，律齊；第2天部分偽足已有融合，搏動(dòng)頻率有所加強(qiáng)，但也較緩，第4天搏動(dòng)頻率明顯，約為75次/分，律齊，并且可觀察到細(xì)胞間已開(kāi)始逐漸相互融合，呈片狀群體性搏動(dòng)，有規(guī)律。第5～6天乳鼠心肌細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，活躍，每搏頻率可達(dá)100次/分以上，律規(guī)整。心肌細(xì)胞在冷刺激時(shí)可視細(xì)胞逐漸分散，核裂解，搏動(dòng)范圍縮小及頻率亦明顯緩慢。圖1

圖1 正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)4℃組（冷刺激時(shí)間3 h）細(xì)胞學(xué)形態(tài)鏡下比較

心肌細(xì)胞凋亡率的結(jié)果：流氏細(xì)胞術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)4℃組和實(shí)驗(yàn)0℃組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率的結(jié)果表明[6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，（3～30）±（0.01～0.03）]：實(shí)驗(yàn)4℃組及實(shí)驗(yàn)0℃組低溫條件下，隨著溫度的下降及低溫時(shí)間延長(zhǎng)，使心肌細(xì)胞的凋亡率增加，由（3.02±0.02）%和（6.74±0.01）%分別增加至（10.79±0.03）%和（28.52±0.03）%，與正常對(duì)照組（1.05±0.02）%相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。圖2

圖2 不同溫度實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞凋亡率的變化

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)結(jié)果：加入100 nmol/L APP10處理前與加入100 nmol/L APP10 處理后，實(shí)驗(yàn)4℃組和實(shí)驗(yàn)0℃組Cx43 mRNA表達(dá)均較正常對(duì)照組均有不同程度的表達(dá)下降（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；

而實(shí)驗(yàn)4℃組和實(shí)驗(yàn)0℃組在加入100 nmol/L APP10處理后，兩組Cx43 mRNA表達(dá)均較同組加入APP10處理前有所增加（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1、圖3

Western blot檢測(cè)結(jié)果： 加入APP10處理前與加入APP10處理后，實(shí)驗(yàn)4℃組和實(shí)驗(yàn)0℃組Cx43、 P-Cx43蛋白表達(dá)均較正常對(duì)照組有不同程度的下降（P均＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在實(shí)驗(yàn)4℃組和實(shí)驗(yàn)0℃組均加入APP10處理后，實(shí)驗(yàn)4℃組和實(shí)驗(yàn)0℃組Cx43、P-Cx43蛋白表達(dá)較同組加入APP10處理前有所增加（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表2、圖4

表1 三組APP 10處理前細(xì)胞Cx43 mRNA和APP10處理后Cx43 mRNA定量值

表1 三組APP 10處理前細(xì)胞Cx43 mRNA和APP10處理后Cx43 mRNA定量值

注：與正常對(duì)照組比*P＜0.01；與同組加入APP10處理前比△P＜0.01。Cx43：縫隙接連蛋白43 APP10：抗心律失常肽10

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表2 三組Cx43、p-Cx43蛋白表達(dá)的變化

表2 三組Cx43、p-Cx43蛋白表達(dá)的變化

注：與正常對(duì)照組比*P＜0.01；與同組加入APP10處理前比△P＜0.01。余注見(jiàn)表1

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圖3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)電泳圖顯示抗心律失常肽10干預(yù)對(duì)不同溫度冷應(yīng)激處理?xiàng)l件下乳鼠心肌細(xì)胞Cx43 mRNA水平的影響

圖4 三組APP10處理前后乳鼠心肌細(xì)胞Cx43及P-Cx43蛋白表達(dá)的變化

3 討論

應(yīng)激是機(jī)體應(yīng)對(duì)生存環(huán)境中一種或多種不良甚至有害因素條件下所產(chǎn)生的全身非特異性反應(yīng)，機(jī)體可表現(xiàn)為應(yīng)對(duì)不同強(qiáng)度刺激下神經(jīng)—內(nèi)分泌系統(tǒng)增強(qiáng)，而作出的適應(yīng)反應(yīng)，主要以交感—腎上腺

髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸（HPA）興奮為主的內(nèi)分泌反應(yīng)，引起機(jī)體兒茶酚胺（如腎上腺素、去甲腎上腺素）物質(zhì)和糖皮質(zhì)激素的分泌增多；從而活化心肌細(xì)胞膜表面的受體，并通過(guò)多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路啟動(dòng)生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)乃至應(yīng)激損傷的發(fā)生。應(yīng)激作為心血管疾病的重要誘因和病因已得到確認(rèn)[7]，有學(xué)者甚至認(rèn)為心血管疾病是第一應(yīng)激性疾病[8]。在寒冷刺激環(huán)境中，高強(qiáng)度的冷暴露使機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體生理功能紊亂，形成損傷及相關(guān)基因和蛋白的改變[9]。目前，關(guān)于寒冷刺激對(duì)Cx43影響的研究甚少。

本研究通過(guò)觀察在不同強(qiáng)度及時(shí)間段給予心肌細(xì)胞急性冷刺激，發(fā)現(xiàn)在隨著刺激強(qiáng)度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞的凋亡率逐漸增加；并觀察到Cx43在基因及蛋白水平上的表達(dá)均有不同程度的降低，說(shuō)明在急性極端條件下（冷刺激強(qiáng)度刺激時(shí)），易促發(fā)心肌細(xì)胞的損傷；而細(xì)胞偶聯(lián)傳導(dǎo)物質(zhì)—Cx43在其機(jī)制中扮演著重要角色。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，可通過(guò)磷酸化快速調(diào)節(jié)效應(yīng)蛋白活性和通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的緩慢生物效應(yīng)的兩種主要作用方式傳導(dǎo)。連接蛋白大多數(shù)都屬于磷蛋白，它們處于不同的磷酸化水平；且磷酸化是蛋白轉(zhuǎn)錄后非常普遍的主要修飾之一；同時(shí)縫隙連接的功能受許多因素的影響。其中，在羧基末端的絲/蘇氨酸及酪氨酸殘基的磷酸化/去磷酸化水平中，它可因胞內(nèi)的信號(hào)變化而改變蛋白的構(gòu)象，從而對(duì)調(diào)節(jié)縫隙連接的傳導(dǎo)性起著至關(guān)重要的作用。但也有研究正面報(bào)道[10]，寒冷刺激可使棕色脂肪組織活性顯著增加，參與了體外心肌自發(fā)分化能力，甚至加強(qiáng)心臟干細(xì)胞分化，從而有效的修復(fù)受損心肌，改善心臟功能等作用；因此仍有頗多爭(zhēng)論。

AAP10是一種小分子多肽物質(zhì)，它可以結(jié)合到一種膜蛋白受體，促進(jìn)細(xì)胞間通訊和傳導(dǎo)功能，產(chǎn)生抗心律失常的作用[11]，但具體機(jī)制目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)觀察到在實(shí)驗(yàn)4℃組和實(shí)驗(yàn)0℃組加入100 nmol/L AAP10干預(yù)后，能使Cx43和P -Cx43的含量表達(dá)均有所提高，由此我們推測(cè)AAP10可能通過(guò)加強(qiáng)蛋白的磷酸化水平來(lái)改善細(xì)胞間的傳導(dǎo)。這一結(jié)果與Weng等[12]所得的結(jié)果相一致。他們采用雙探頭膜片鉗技術(shù)研究AAP10對(duì)成年豚鼠心肌細(xì)胞及轉(zhuǎn)染了Cx43細(xì)胞的縫隙連接傳導(dǎo)的影響，結(jié)果顯示AAP10能促進(jìn)這兩種細(xì)胞間的電傳導(dǎo)；并且通過(guò)使用PKC阻斷劑BIM，PKCα亞型阻斷劑CGP54345等，同時(shí)使用ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AAP10主要促進(jìn)PKC介導(dǎo)的Cx43磷酸化作用來(lái)改善細(xì)胞間的傳導(dǎo)；也有研究報(bào)道顯示[13]，縫隙連接蛋白阻滯劑—Heptanol可使Cx43表達(dá)增加，使缺血心肌與正常心肌電傳導(dǎo)差異性減少，改善電重構(gòu)，從而發(fā)揮預(yù)防缺血性室性心律失常的作用。

綜上所述，極端氣候條件下（急性冷應(yīng)激刺激）對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡或損傷具有顯著影響，且能使細(xì)胞間通訊傳導(dǎo)功能明顯下降，使Cx43和P-Cx43表達(dá)均有下降；而AAP10改善細(xì)胞間的傳導(dǎo)主要通過(guò)促進(jìn)蛋白磷酸化水平而起作用。但至今為止，磷酸化對(duì)縫隙連接蛋白通道的調(diào)控，仍有許多問(wèn)題有待進(jìn)一步研究，可能涉及到許多復(fù)雜因素的參與，如縫隙連接不同的亞型、Cx43蛋白許多不同的磷酸化位點(diǎn)、不同的激酶和蛋白磷酸化的參與以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑網(wǎng)的相互作用等等，且本實(shí)驗(yàn)未從動(dòng)物整體研究，未涉及到復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制網(wǎng)；因此關(guān)于磷酸化如何影響縫隙連接通道細(xì)胞間的傳導(dǎo)，還有待今后進(jìn)一步探索和研究。

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Effect of Cold Stress on Connexin43 Protein Expression With Drug Intervention in Neonatal Rats’Myocardial Cells

HUANG Qiang-hui, HONG Kui, CHENG Xiao-shu, HU Jian-xin.
Department of Cardiology, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang (330006), Jiangxi, China

Objective: To study the effects of acute cold stress on connexin43 (Cx43) protein expression with drug intervention, and cell to cell conduction with its mechanism in neonatal rats’ myocardial cells.

Cold stress; Myocardial cells; Connexin43; Phosporylation; Anti-arrhythmia peptide

2014-04-10）

（編輯: 汪碧蓉）

330006 江西省南昌市，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 心內(nèi)科

黃強(qiáng)輝 住院醫(yī)師 碩士 主要從事心血管病研究 Email：277066217@qq.com 通訊作者：胡建新 Email：hujianxin@medmail.com

R54

A

1000-3614( 2015 )01-0059-05

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2015.01.016