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    液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定煙草中6種Amadori化合物

    2015-12-14 08:23:42賈春曉修龍飛牟定榮毛多斌
    質(zhì)譜學(xué)報 2015年1期
    關(guān)鍵詞:水溶液串聯(lián)液相

    賈春曉,修龍飛,牟定榮,毛多斌

    (1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院,河南鄭州 450002;2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450002;3.紅塔煙草(集團)有限公司技術(shù)中心,云南玉溪 653100)

    液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定煙草中6種Amadori化合物

    賈春曉1,修龍飛2,牟定榮3,毛多斌2

    (1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院,河南鄭州 450002;2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450002;3.紅塔煙草(集團)有限公司技術(shù)中心,云南玉溪 653100)

    建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定煙草中6種Amadori化合物的定性和定量分析方法。試樣以70%甲醇水溶液為萃取劑,經(jīng)過正交實驗優(yōu)化后的超聲萃取條件為:料液比1∶30、萃取功率120W,萃取時間25min。所得萃取液用正己烷洗滌除去雜質(zhì)后,在選擇反應(yīng)監(jiān)測模式下進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定性及定量分析,其中Amadori化合物采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。結(jié)果表明:所測定的6種Amadori化合物線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r均大于0.995 0。方法的檢出限(LOD)為20.06~39.86μg/kg,定量限(LOQ)為66.85~132.9μg/kg,平均回收率在86.56%~88.86%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5%。該方法簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好,適用于煙草中Amadori化合物的定性和定量分析。

    煙草;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS);Amadori化合物

    Amadori化合物是由還原糖和氨基酸經(jīng)縮合、脫水、Amadori重排而得到的一類Mainland反應(yīng)中間產(chǎn)物,即1-氨基-1-脫氧-2-酮糖[1],它是煙草中一種重要的香味前體物質(zhì)[2]。Amadori化合物在通常狀態(tài)下沒有氣味,但在卷煙燃吸過程中,能夠裂解釋放出對卷煙香氣具有重要貢獻的香味物質(zhì),如吡嗪類、呋喃類以及吡咯類化合物等[3-4]。因此,研究其萃取條件和分析其在煙草中的含量,對評價煙草的內(nèi)在質(zhì)量及提高卷煙香氣具有重要的指導(dǎo)意義。

    Amadori化合物極性強、種類多、結(jié)構(gòu)類似,對其進行定性定量分析難度較大[5]。目前,國內(nèi)外對于Amadori化合物的分析主要采用氣相色譜(GC)法[6]、高效液相色譜(HPLC)法[7-9]、高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC/MS)法[10]、離子交換色譜(IEC)法和離子交換色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(IEC-MS/MS)法[11-13]等,其中,HPLC/MS和IEC-MS/MS法是目前最有效的定性分析方法。然而,由于沒有市售標(biāo)準(zhǔn)品,采用標(biāo)準(zhǔn)樣品同時進行Amadori化合物的定量分析研究鮮有報道。

    液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)具有快速、簡便、靈敏度高等優(yōu)點[14-15]。本研究擬采用超聲波輔助萃取,并通過正交實驗優(yōu)化前處理條件,在此基礎(chǔ)上采用LC-MS/MS技術(shù),并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)樣品,對煙草中的Amadori化合物進行定性鑒定;另外,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對煙草中的6種Amadori化合物進行定量測定。

    1 實驗部分

    1.1 儀器

    LTQ XL型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:美國Thermo公司產(chǎn)品,配有電噴霧離子源(ESI)及Xcalibur 2.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);KQ-5200DB型超聲波清洗儀:昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵:鄭州市中原科技儀器廠產(chǎn)品;AB265-S型分析天平(感量0.000 01g):瑞士Mettler公司產(chǎn)品;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品;Mili-Q超純水儀:美國Milipore公司產(chǎn)品。

    1.2 主要材料與試劑

    甘氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Gly)、丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Ala)、脯氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Pro)、蘇氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Thr)、谷氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Glu)、α-氨基丁酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Amb)標(biāo)準(zhǔn)對照品:本課題組用化學(xué)合成法自制,其結(jié)構(gòu)經(jīng)紅外光譜、核磁共振、多級質(zhì)譜及高分辨質(zhì)譜表征,純度均大于98%;實驗用水:Mili-Q超純水;甲醇(色譜純)、無水甲醇(分析純):天津四友精細化工有限公司產(chǎn)品;正己烷(分析純):天津市凱通化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;甲酸:美國Acros Organics公司產(chǎn)品。

    1.3 煙葉樣品的前處理

    各種煙葉樣品均由紅塔煙草集團提供。將煙葉樣品于30℃烘干粉碎,過60目篩。準(zhǔn)確稱取2.000g煙葉粉末,置于帶塞錐形瓶中,加入70%甲醇水溶液,在料液比1∶30,功率120W的條件下,超聲萃取20min;抽濾后,濾渣用70%甲醇水溶液洗滌3次(每次30mL),合并濾液和洗滌液,在減壓條件下于30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)

    濃縮至干;然后,用50mL 70%甲醇水溶液溶解,正己烷洗滌3次(每次30mL),以除去色素等雜質(zhì);將洗滌后的甲醇-水相濃縮至干,再用70%甲醇水溶液定容至10mL,過0.45μm有機濾膜,待LC-MS/MS分析。

    1.4 實驗條件

    1.4.1 色譜條件 色譜柱:Thermo Hypersil Gold(100mm×2.1mm×1.9μm);流動相:甲醇-水(0.1%甲酸)溶液(50∶50,V/V);等度洗脫;流速200μL/min;柱溫20℃;自動進樣,進樣量2μL。

    1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),正離子掃描,選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM),離子源噴霧電壓5kV,毛細管電壓12V,透鏡電壓50V,毛細管溫度350℃,氣體(N2)壓力250kPa,質(zhì)量掃描范圍m/z 200~500。6種目標(biāo)化合物的定性和定量離子對及碰撞能量等參數(shù)列于表1。

    表1 Amadori化合物質(zhì)譜檢測條件Table 1 MS/MS conditions for the detection of Amadori compounds

    2 結(jié)果與討論

    2.1 超聲萃取條件的優(yōu)化

    2.1.1 單因素實驗 考察萃取條件時,以煙葉樣品中Amadori化合物的實際萃取量為指標(biāo)。因為萃取量與其峰面積成正比,所以用6種Amadori化合物的總峰面積的對數(shù)值代表其總萃取量,以煙葉中Amadori化合物的總萃取量為指標(biāo),分別考察了萃取溶劑、所選溶劑濃度、料液比(煙葉樣品質(zhì)量與萃取溶劑體積之比,g/mL)、超聲功率和萃取時間對萃取量的影響。

    由于Amadori化合物具有較大的極性,因此分別選用甲醇、乙醇、二氯甲烷和乙腈為萃取溶劑,固定其他條件對煙葉樣品進行萃取。結(jié)果表明,甲醇的萃取效果最好。根據(jù)上述結(jié)果,又考察了不同濃度的甲醇水溶液(50%、60%、 70%、80%、90%)對萃取量的影響。結(jié)果表明,用70%甲醇水溶液作為萃取溶劑時,Amadori化合物的總萃取量最大。

    以70%甲醇水溶液作為萃取溶劑,分別考察了不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50),不同超聲功率(80、100、120、140、160W)以及不同萃取時間(10、15、20、25、30min)的萃取結(jié)果,示于圖1。由圖1可知,當(dāng)料液比為1∶30,超聲功率為120W,超聲時間為20min時,總萃取量達到最大值。

    2.1.2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果分析 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以料液比(A)、萃取功率(B)、萃取時間(C)為影響因素進行正交實驗,選用L9(34)正交實驗表安排實驗因素水平。正交實驗因素水平表及正交結(jié)果分別列于表2和表3。

    圖1 料液比,超聲功率和萃取時間對萃取結(jié)果的影響Fig.1 The effect of solid-liquid ratio,ultrasonic power and extraction time vs extraction results

    表2 正交實驗因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

    由表3可知,極差R是各因素對Amaodri化合物萃取因素的影響程度,因素主次順序為A>B>C,即萃取料液比是影響提取效果的主要因素,其次為萃取功率,而萃取時間的影響最小。比較K1、K2、K3可知,Amadori化合物的最佳萃取條件為A2B2C3,即料液比1∶30、萃取功率120W、萃取時間25min。

    2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

    表3 正交實驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiments

    Amadori化合物含有羧基和多個羥基,容易加和氫離子形成正電荷母離子[M+1]+,因此,選用正離子模式對Amadori化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行全掃描,以確定分子離子峰。然后優(yōu)化碰撞能量,使母離子進一步碎裂,并對其子離子進行全掃描。在此基礎(chǔ)上,選擇2個信噪比高、峰形好、干擾小的特征子離子作為定性離子對,并將響應(yīng)值最高的2個子離子作為定量離子對,采用SRM掃描模式,該方法鑒別點

    (IPs)均能滿足歐盟2002/657/EC的決議要求[16]。所得6種Amadori化合物的SRM色譜圖示于圖2。

    2.3 線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

    準(zhǔn)確稱取0.010 20g Fru-Gly、0.022 03g Fru-Ala、0.194 90g Fru-Pro、0.015 82g Fru-Thr、0.010 05g Fru-Glu,0.031 24g Fru-Amb,用70%甲醇水溶液溶解,定容至50mL容量瓶中,配制成混標(biāo)儲備液。分別用移液管移取0.10、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、10.0mL混標(biāo)儲備液于10mL容量瓶中,用70%甲醇水溶液定容,得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.4節(jié)條件進行測定,分別以相應(yīng)的Amadori化合物離子峰面積y對濃度x擬合線性方程,相關(guān)系數(shù)r均大于0.995 0,各組分的線性方程、線性范圍、檢出限、定量限列于表4。

    2.4 回收率和精密度實驗

    準(zhǔn)確稱取2.000g煙葉樣品,按照1.3節(jié)方法進行處理,按1.4節(jié)條件進行分析,測定6種Amadori化合物的含量,平行測定5次,計算平均含量及RSD1,結(jié)果列于表5。

    采用實際樣品添加標(biāo)樣的方法測定回收率。取2.000g煙葉樣品粉末,分別加入一定量的Amadori化合物標(biāo)樣,按1.3節(jié)和1.4節(jié)的方法進行處理與分析,并根據(jù)6種Amadori化合物的原含量、加標(biāo)量和測定量計算回收率和RSD2,結(jié)果列于表5。

    2.5 實際樣品的測定

    采用本方法對12個煙樣進行測定,平行測定3次,取峰面積的平均值,通過外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算相應(yīng)的Amadori化合物含量,結(jié)果列于表6。

    圖2 六種Amadori化合物的SRM色譜圖Fig.2 SRM chromatogram of 6 kinds of Amadori compounds

    表4 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 4 Linear equations,correlation coefficients,limits of detection and limits of quantification

    表5 回收率與精密度結(jié)果(n=5)Table 5 Results of recovery and precision(n=5)

    表6 實際樣品測定Table 6 Determination of actual samples

    3 結(jié)論

    建立了LC-MS/MS同時測定煙草中6種Amadori化合物的定性和定量分析方法。優(yōu)化了前處理提取方法,確定的最優(yōu)萃取條件為:萃取劑為70%甲醇,超聲功率120W,超聲時間25min,料液比1∶30;6種Amadori化合物的測定線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r均大于0.995 0;方法的檢出限(LOD)為20.06~39.86μg/kg,定量限(LOQ)為66.85~132.9μg/kg,平均回收率在86.56%~88.86%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。該方法的前處理簡單、定量限低,回收率和精密度均能滿足煙草中Amadori化合物的分析要求,可為我國煙草行業(yè)香味前體物質(zhì)的研究提供技術(shù)支持。

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    Simultaneous Determination of Six Kinds of Amadori Compounds in Tobaccos by LC-MS/MS

    JIA Chun-xiao1,XIU Long-fei2,MOU Ding-rong3,MAO Duo-bin2
    (1.College of Material and Chemical Engineering of Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou450002,China;2.College of Food and Bioengineering of Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou450002,China;3.Research and Development Center of Hongta Tobacco(Group)Corporation.,Ltd,Yuxi 653100,China)

    A liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)method for qualitatively and quantitatively analyzing six kinds of Amadori compounds(Fru-Gly,F(xiàn)ru-Ala,F(xiàn)ru-Pro,F(xiàn)ru-Thr,F(xiàn)ru-Glu and Fru-Amb)in tobaccos was developed.The sample was extracted with 70%methanol water solutionsand assisted by ultrasound,and the extraction conditions which were optimized by orthogonal experiment as followings:the solid liquid ratio was 1∶30,the extraction power was 120W,and the extrac-

    tobacco;liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS);Amadori compounds

    O 657.63

    A

    1004-2997(2015)01-0045-07

    10.7538/zpxb.youxian.2014.0052

    2014-03-10;

    2014-04-24

    國家自然科學(xué)基金(21176229/B060804);中國煙草總公司卷煙增香保潤重大科技專項(110201101025(BR-07)資助

    賈春曉(1965—),女(漢族),河南南陽人,教授,從事天然產(chǎn)物和煙草化學(xué)方面研究。E-mail:jiachx@zzuli.edu.cn

    毛多斌(1962—),男(漢族),河南南陽人,教授,從事煙草化學(xué)和有機合成方面研究。E-mail:maoduobin@zzuli.edu.cn

    時間:2014-08-20;

    http:∥www.cnki.net/kcms/doi/10.7538/zpxb.youxian.2014.0052.html

    tion time was 25min.The extraction products from tobaccos were cleaned up by hexane and then analyzed by LC-MS/MS under the selected reaction monitoring(SRM)mode.The contents of six kinds of Amadori compounds were determined by external standard curve method.The results show that the limits of detection(LOD)are 20.06-39.86μg/kg,and limits of quantity(LOQ)are 66.85-132.9μg/kg.The correlation coefficients are greater than 0.995 0,the average recoveries are 86.56%-88.86%,and the relative standard deviations(RSD)are less than 5%.This method is simplify,sensitive and accurate,which is suitable for qualitative and quantitative analysis of Amadori compounds in tobaccos.

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