參術(shù)活血顆粒中揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物制備工藝研究

吳電彩，汪海斌，馬 玲，張 毅，陳師農(nóng)，孫 備，黃順旺，，宋少江

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥 230031;2.安徽省藥物研究所·安徽省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230022;3.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

參術(shù)活血顆粒來(lái)源于醫(yī)院臨床驗(yàn)方，應(yīng)用臨床多年，具有益氣健脾，活血散結(jié)的功效，主治氣滯血瘀型子宮肌瘤。處方有十味藥材組成，其中莪術(shù)、當(dāng)歸等四味藥材均含有揮發(fā)油成分，具有活血、行氣、止痛等作用［1］，與本制劑的功效相符。為最大限度的提取揮發(fā)油和增加揮發(fā)油在制劑中的穩(wěn)定性，我們對(duì)參術(shù)活血顆粒處方中的莪術(shù)、當(dāng)歸等四味藥材的揮發(fā)油提取和包合工藝進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

AR1140型電子天平(上海加惠儀器儀表有限公司)，揮發(fā)油測(cè)定器，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(陜西太康生物科技有限公司)，JJ-2高速組織搗碎機(jī)(江蘇金壇市億通電子有限公司)，冷凍干燥機(jī)(上海比朗儀器有限公司)，真空干燥箱(上海越眾儀器設(shè)備有限公司)，KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);藥材均購(gòu)自合肥市樂(lè)家老鋪中藥飲片有限公司，經(jīng)鑒定符合《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定，β-環(huán)糊精純度大于99%(上海化學(xué)試劑站中心化工廠)，硅膠G板(5 cm×10 cm，薄層層析用，青島海洋化工分廠)，其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素法優(yōu)選揮發(fā)油提取工藝

2.1.1 揮發(fā)油加水量的考察 按處方量配比稱取莪術(shù)、當(dāng)歸等四味味藥材3份，每份340 g，置揮發(fā)油提取器中，分別加入規(guī)定量水(見(jiàn)表1)，浸泡12 h，按《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄揮發(fā)油測(cè)定法提取揮發(fā)油，從水微沸開(kāi)始記錄不同加水量所得揮發(fā)油量(mL)，提取6 h，以揮發(fā)油總量為指標(biāo)，考察不同加水量對(duì)揮發(fā)油量的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加水量對(duì)揮發(fā)油提取量的影響

由表1可知，當(dāng)加水量為藥材重量的8倍時(shí)，揮發(fā)油提取總量最高，故選擇加8倍量水提取揮發(fā)油。

2.1.2 揮發(fā)油提取時(shí)間考察 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按處方量配比稱取莪術(shù)、當(dāng)歸等四味味藥材2份，每份340 g，分別加入8倍量水浸泡12 h，提取揮發(fā)油6 h，以揮發(fā)油總量為指標(biāo)，記錄不同時(shí)間的揮發(fā)油總量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 提油時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取量的影響/mL

由表2可知，5 h后，揮發(fā)油總量基本不再增加，因此提取揮發(fā)油時(shí)間選擇5 h。因此揮發(fā)油提取最佳工藝為:加8倍量水，提取5 h。

2.1.3 揮發(fā)油提取驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方量配比稱取莪術(shù)、當(dāng)歸等四味藥材3份，每份340 g，加8倍量水，用揮發(fā)油提取器分別提取揮發(fā)油，提取5 h，記錄揮發(fā)油量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 揮發(fā)油提取驗(yàn)證

由表3可知:加8倍量水，揮發(fā)油提取5 h較完全，且揮發(fā)油得量較穩(wěn)定。

2.2 揮發(fā)油 β-CD 包合工藝研究［2－4］

2.2.1 包合物的制備 按比例取β-CD于具塞錐形瓶中，加蒸餾水100 mL，水浴至所需溫度，振搖使β-CD溶解成飽和溶液。緩慢滴入無(wú)水乙醇溶解的揮發(fā)油，攪拌至試驗(yàn)規(guī)定時(shí)間后，4～10℃冰箱中冷藏24 h，抽濾，并分別用水，石油醚(30～60℃)洗滌包合物(各3次，每次5 mL)，并將濾餅放在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，稱重，即得。

2.2.2 包合物中含油量的測(cè)定 將制得的包合物置圓底燒瓶中，加蒸餾水300 mL，連接揮發(fā)油提取器，按照2010年版《中國(guó)藥典》揮發(fā)油測(cè)定項(xiàng)下［1］有關(guān)操作，提取至揮發(fā)油不再增加后，停止加熱，放置1 h后讀取揮發(fā)油量，并計(jì)算揮發(fā)油的含量(%)。

同時(shí)進(jìn)行揮發(fā)油空白回收率測(cè)定。精密量取揮發(fā)油1 mL置圓底燒瓶中，加蒸餾水300 mL，同上法操作，計(jì)算空白回收率為80%。再計(jì)算揮發(fā)油包合率和包合物收率，公式如下。

2.2.3 包合條件的優(yōu)選 (1)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì):根據(jù)文獻(xiàn)資料，影響揮發(fā)油包合的主要因素為β-CD與揮發(fā)油的比例(A)、攪拌時(shí)間(B)、包合溫度(C)，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以包合率和包合物收率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，篩選最佳工藝條件。選用L9(34)正交試驗(yàn)表頭。包合工藝的因素水平見(jiàn)表4。

表4 包合工藝的因素水平

(2)正交試驗(yàn)結(jié)果及分析:L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

直觀分析:由表5可知，以包合率為考察指標(biāo)時(shí)，A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，最佳工藝為A3B2C3。以包合物收率為考察指標(biāo)時(shí)，A2＞A3＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，最佳工藝為A2B2C3。

方差分析:由表6、表7可知，以包合率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，A因素、B因素有顯著性意義，C因素?zé)o顯著意義，重要性依次為A＞B＞C;以包合物收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，A因素、B因素、C因素均無(wú)顯著性意義，重要性依次為A＞B＞C。

綜上所述，考慮到包合率和包合物收率的權(quán)重系數(shù)，包合率占主要比重，確定最佳包合工藝為A3B2C3，即揮發(fā)油與β-CD比例為1∶8，加1.5倍量無(wú)水乙醇溶解揮發(fā)油，包合溫度60℃，包合時(shí)間60 min。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 包合率方差分析結(jié)果表

表7 包合物收率方差分析結(jié)果表

2.2.4 包合物驗(yàn)證試驗(yàn) 按正交試驗(yàn)優(yōu)選的包合工藝方案平行進(jìn)行3次試驗(yàn)，投油量2.0 mL，β-CD量16 g，加1.5倍量無(wú)水乙醇溶解，經(jīng)包合后得平均包合率為63.22%，包合物收率為83.92%。證明此工藝合理可行。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 包合驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.3 包合物質(zhì)量考察［4－5］

2.3.1 顯微成像法 取含揮發(fā)油的包合物與空白包合物(β-CD)各少許，用水裝片置顯微鏡下(放大倍數(shù)400倍)觀察。結(jié)果:空白包合物為規(guī)則的半透明板狀結(jié)晶(圖1)，含揮發(fā)油的包合物為不規(guī)則的粉末狀(圖2)。證明揮發(fā)油與β-CD已形成包合物。

2.3.2 薄層色譜法 取揮發(fā)油0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，作為對(duì)照品溶液;取β-CD 包合物0.5 g，加石油醚(30 ～60℃)25 mL，超聲提取15 min，濾過(guò)，濾液揮干，加無(wú)水乙醇1 mL作為供試品溶液;另取β-CD 0.5 g加無(wú)水乙醇25 mL，超聲提取15 min，濾過(guò)，濾液濃縮至1 mL作為陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各2μL，對(duì)照品溶液1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)—丙酮—乙酸乙酯(93∶5∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，不顯示斑點(diǎn)(圖3)。

由薄層色譜圖可知，包合后的揮發(fā)油與未包合揮發(fā)油成分基本一致，本品揮發(fā)油經(jīng)β-CD包合后其成分沒(méi)有明顯變化，故包合工藝合理，可行。

3 討論［6－12］

包合物制備方法的選擇:我們采用高速組織搗碎法、β-CD飽和水溶液電動(dòng)攪拌法和超聲法3種方法對(duì)包合物的制備進(jìn)行比較，結(jié)果高速組織攪碎法和飽和水溶液電動(dòng)攪拌法均有較滿意的包合效果，但考慮到工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備實(shí)際情況，故選擇了飽和水溶液電動(dòng)攪拌法。

包合物干燥方法的選擇:包合物制備完成后，包合物的干燥方法也是影響包合物質(zhì)量的主要因素之一。常用的干燥方法有減壓干燥、冷凍干燥、噴霧干燥等，我們采用50℃減壓干燥，冷凍干燥(冷凍溫度-40℃，真空度10 Pa，時(shí)間3 h)，比較發(fā)現(xiàn)冷凍干燥效果更好，目前冷凍干燥設(shè)備已普遍應(yīng)用于藥品生產(chǎn)企業(yè)，所以選擇冷凍干燥法。

參術(shù)活血顆粒揮發(fā)油最佳提取工藝為:加8倍量水，提取5 h;揮發(fā)油最佳包合工藝為:取揮發(fā)油與 β-CD 比例為1∶8(mL∶g)，包合時(shí)間 60 min，包合溫度為60℃。此方法簡(jiǎn)單，設(shè)備要求不高，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。揮發(fā)油經(jīng)β-CD包合后，經(jīng)顯微成像法和薄層色譜法鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)形成新的物象，包合前后揮發(fā)油成分基本一致。

β-CD包合技術(shù)為中藥新藥研究常用的新技術(shù)。本制劑中的揮發(fā)性成分采用β-CD包合，有效避免揮發(fā)油有效成分損失及貯藏中的不穩(wěn)定，增加了水溶性，減少了異味和刺激性，提高了藥物的穩(wěn)定性和有效性。

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