河蜆中水溶性蛋白的提取及其抗氧化性質(zhì)

楊玉孌，袁美蘭，陳麗麗，白春清，趙 利*，石 嶺，蘇 偉

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（南昌），江西 南昌 330013）

河蜆中水溶性蛋白的提取及其抗氧化性質(zhì)

楊玉孌，袁美蘭，陳麗麗，白春清，趙 利*，石 嶺，蘇 偉

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（南昌），江西 南昌 330013）

研究超聲波輔助法提取河蜆?biāo)苄缘鞍椎墓に?。以水溶蛋白的提取率為考察指?biāo)，以料液比、提取時(shí)間、提取溫度和超聲功率為考察因素，采用響應(yīng)面法對(duì)河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛」に嚄l件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，并對(duì)其進(jìn)行抗氧化研究。結(jié)果表明：最佳河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛」に嚄l件為料液比1∶20、提取時(shí)間23 min、提取溫度48 ℃、超聲功率920 W，此條件下河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷蔬_(dá)到最大值，為67.70%。其中，提 取時(shí)間和超聲功率對(duì)河蜆?biāo)艿鞍滋崛÷实挠绊戯@著。超聲波的空化和振動(dòng)作用可以促進(jìn)細(xì)胞的破碎，使目標(biāo)產(chǎn)物與溶劑充分混合，增大提取率，縮短提取時(shí)間，對(duì)河蜆中水溶性蛋白的提取具有很大意義。河蜆提取液具有較強(qiáng)的清除1′1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、超氧陰離子自由基的能力和較強(qiáng)的鐵離子還原能力，而清除羥自由基的能力較弱。

河蜆；水溶性蛋白；超聲波；提?。豢寡趸?/p>

河蜆（Corbicula fluminea），俗稱沙蜊和蜊潦，屬于瓣腮綱、真瓣鰓目、異齒亞目、蜆科、蜆屬，是雙殼類軟體動(dòng)物[1]。它生長速度快、繁殖能力強(qiáng)、養(yǎng)殖產(chǎn)量大、資源豐富，分布于淡水或咸淡水的江河、湖泊及入海口，原產(chǎn)于我國，現(xiàn)廣泛存在于世界各地水域。

河蜆營養(yǎng)豐富，味道鮮美，具有很高的食用價(jià)值和保健作用，作為中藥材，具有開胃、通乳、明目、利尿、去濕毒、治療肝病、麻疹、退熱、止咳化痰和解酒等功效[2]。近年來，人們研究還發(fā)現(xiàn)河蜆含有很多具有生物活性的糖蛋白，這是一類由糖類和蛋白質(zhì)或多肽以共價(jià)鍵連接而形成的結(jié)合蛋白[3]，具有抗腫瘤、免疫活性、抗氧化、抗炎和抗血栓等生物活性[4-5]。祝雯等[6]從河蜆?biāo)苄缘鞍字蟹蛛x純化獲得堿性糖蛋白CFp-a，發(fā)現(xiàn)其對(duì)體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞BEL7404生長具有抑制作用。Huang Yingtang等[7]發(fā)現(xiàn)河蜆的乙酸乙酯抽提物對(duì)HL-60、u937和HePGZ細(xì)胞有抑制作用，并能引起HL-60的細(xì)胞凋亡。莊平等[8]發(fā)現(xiàn)河蜆中含有豐富的多不飽和脂肪酸，具有預(yù)防心腦血管疾病、增強(qiáng)記憶力和抗癌等多種特殊生理功能。邱乒乒等[9]研究發(fā)現(xiàn)，河蜆的甲醇或乙酸乙酯萃取物對(duì)肝癌細(xì)胞株的抑制作用。河蜆是一種濾食性的動(dòng)物，對(duì)高濃度的有機(jī)物污染物[10]、重金屬等淡水中常見污染物反應(yīng)靈敏，并對(duì)于中、低濃度的污染具有相當(dāng)高的蓄積能力，因此河蜆可以作為水環(huán)境中的污染物尤其是重金屬污染物的監(jiān)測(cè)指示生物。河蜆對(duì)有毒物質(zhì)的吸收和降解機(jī)制主要依賴于體內(nèi)存在的金屬硫蛋白，同時(shí)體內(nèi)的相關(guān)蛋白和縮氨酸也能對(duì)重金屬產(chǎn)生抑制作用[11-14]。

超聲波是物質(zhì)介質(zhì)中的一種彈性機(jī)械波，具有波長較短和能量集中的特點(diǎn)。超聲振動(dòng)引起的與媒質(zhì)的相互作用主要有熱作用、機(jī)械作用和空化作用。熱作用可使組織內(nèi)部的溫度瞬間升高，加速有效成分的溶出，并且不改變成分的性質(zhì)。機(jī)械作用可在液體中形成有效地?cái)噭?dòng)與流動(dòng)，破壞介質(zhì)的結(jié)構(gòu)，粉碎液體中的顆粒，能達(dá)到普通低頻機(jī)械攪動(dòng)達(dá)不到的效果?？栈饔每蓪?dǎo)致細(xì)胞在溶劑中隨瞬時(shí)產(chǎn)生的空化泡崩饋而破裂，以便溶劑滲透到細(xì)胞內(nèi)部，而使細(xì)胞中的化學(xué)成分溶于溶劑之中。超聲波技術(shù)已廣泛應(yīng)用于黃酮類[15]、多糖[16]、生物堿[17]、鳥苷[18-20]、蛋白質(zhì)[21]和油脂[22]等的提取。

河蜆蛋白和多糖具有一定的清除自由基功能，自由基是人體在生命活動(dòng)過程中發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)的中間產(chǎn)物，在正常情況下，自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，但是當(dāng)處于氧應(yīng)激狀態(tài)產(chǎn)生自由基的量超出清除系統(tǒng)的能力時(shí)，過量的自由基會(huì)給機(jī)體造成不可逆轉(zhuǎn)的氧化損傷，從而加快衰老，誘發(fā)心血管疾病、癌癥和糖尿病等諸多疾病[23]。因此，如何清除自由基，防止氧化對(duì)生物體細(xì)胞和組織的損傷受到了普遍關(guān)注。適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充外源性抗氧化劑可以提高機(jī)體抗氧化水平，維持生物體的氧化還原平衡，抵御自由基的損害，幫助機(jī)體抵御疾病。本實(shí)驗(yàn)利用超聲波技術(shù)輔助提取河蜆中水溶性蛋白并研究了其抗氧化活性，有助于提高農(nóng)產(chǎn)品資源的精深加工水平和增值轉(zhuǎn)化效率，既有較高的理論價(jià)值也有較大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益，具有廣闊的生產(chǎn)應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮河蜆，殼長1.5～2.5 cm采于鄱陽湖水域。

1′1-二苯基-2-三硝基苯肼（1′1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、三吡啶吖嗪 美國Sigma公司；鄰菲 羅啉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HF-2B超聲循環(huán)提取機(jī) 北京弘祥隆生物技術(shù)股份有限公司；JJ-2高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；TDL-5A離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；JML60膠體磨 溫州市七星乳品設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 原料處理

鮮活河蜆吐砂2 d后，熱燙剝殼取肉，組織搗碎機(jī)搗碎后用膠體磨勻漿。

1.2.2 河蜆肉成分的測(cè)定

水分含量：參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》；蛋白質(zhì)含量：參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；灰分含量：參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》；總糖含量：參照GB/T 9695.31—2008《肉制品：總糖含量的測(cè)定》。

1.2.3 河蜆?biāo)苄缘鞍椎某曁崛?/p>

1.2.3.1 料液比對(duì)河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实挠绊?/p>

準(zhǔn)確稱取5 份河蜆勻漿，每份30 g，分別加入300、450、600、750 mL和900 mL蒸餾水，即料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30（g/mL）。設(shè)定溫度50 ℃、超聲波功率400 W、提取20 min，5 000r/min離心20 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)含量，每個(gè)水平分別重復(fù)3 次。

1.2.3.2 提取時(shí)間對(duì)河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实挠绊?/p>

準(zhǔn)確稱取5 份河蜆勻漿，每份30 g，加入750 mL蒸餾水，在溫度50 ℃、超聲波功率400 W的條件下分別提取10、15、20、25 min和30 min，5 000r/min離心20 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)含量，每個(gè)水平分別重復(fù)3 次。

1.2.3.3 提取溫度對(duì)河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实挠绊?/p>

準(zhǔn)確稱取5 份河蜆勻漿，每份30 g，加入750 mL蒸餾水，設(shè)定超聲波功率400 W，溫度分別為30、40、50、60 ℃和70 ℃，提取25 min，5 000r/min離心20 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)含量，每個(gè)水平分別重復(fù)3 次。

1.2.3.4 超聲功率對(duì)河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实挠绊?/p>

準(zhǔn)確稱取5 份河蜆勻漿，每份30 g，加入750 mL蒸餾水，設(shè)定溫度50 ℃，超聲波功率分別為200、400、600、800 W和1 000 W，提取25 min，5 000r/min離心20 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)含量，每個(gè)水平分別重復(fù)3 次。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)確定的最佳試驗(yàn)因素水平的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，采用Design Expert v7.1.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化以及分析。

1.2.5 河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实臏y(cè)定

提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮測(cè)定其總糖和總蛋白含量，方法同1.2.2節(jié)，按式（1）計(jì)算河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷省?/p>

式中：c1為離心前提取液中蛋白質(zhì)含量；c2為離心后上清液中蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 提取液抗氧化性的測(cè)定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可見光區(qū)最大吸收峰為517 nm[24]，當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時(shí)，孤對(duì)電子被配對(duì)，吸收消失或減弱。其原理是通過分子中1 個(gè)穩(wěn)定的DPPH自由基與抗氧化劑提供的1 個(gè)電子配對(duì)結(jié)合，使DPPH的特征紫色消失[25-26]。DPPH自由基清除活性的測(cè)定參照Yuan[27]、Li Xiaolan[28]等的方法并稍作修改。取經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的河蜆提取液2 mL于試管中加入2 mL的DPPH溶液（0.1 mmol/L 0.004%），輕輕振蕩，使充分混勻，在避光環(huán)境下反應(yīng)30 min，用分光光度計(jì)于517nm波長處測(cè)定吸光度?？瞻捉M為以水代替河蜆提取液，為了使實(shí)驗(yàn)更精確避免試劑對(duì)樣品的干擾，設(shè)置樣品干擾實(shí)驗(yàn)組以無水乙醇代替DPPH溶液。按式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A1為樣品的吸光度；A0為空白實(shí)驗(yàn)組的吸光度；A2為樣品干擾實(shí)驗(yàn)組的吸光度。

1.2.6.2 羥自由基（·OH）清除率的測(cè)定

·OH的反應(yīng)時(shí)間短，半衰期為10—9s左右，是進(jìn)攻性最強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)之一，·OH的清除其實(shí)是抗氧化物有效抑制了經(jīng)Fenton反應(yīng)后·OH的產(chǎn)生[29]。其反應(yīng)原理是用鄰二氮菲-Fe2＋氧化法檢測(cè)，H2O2與二價(jià)鐵離子發(fā)生Fenton反應(yīng)生成·OH，·OH可把體系中鄰二氮菲-Fe2＋氧化成鄰二氮菲-Fe3＋，使在536 nm波長處的最大吸收峰減弱[30-31]，通過紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定加入抗氧化劑前后吸光度變化計(jì)算自由基清除率?！H清除率的計(jì)算如式（3）所示：

式中：A1為樣品的吸光度；A0為空白對(duì)照，用雙蒸水代替樣品的吸光度；A2為干擾實(shí)驗(yàn)，用雙蒸水代替除樣品以外的物質(zhì)的吸光度。

1.2.6.3 鐵離子還原力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）的測(cè)定

制作FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線：將醋酸鹽緩沖液（0.3 mol/L、pH 3.7）、氯化鐵溶液（0.02 mol/L）和三吡啶吖嗪溶液（0.0l mol/L），用0.04 mol/L的鹽酸溶液配制，以10∶1∶1的體積比混勻，獲FRAP試劑。取0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mL FeSO4溶液 （1.0 mmol/L）于7 支試管中，分別加水至1.0mL，再分別加入5.0 mL FRAP試劑?；靹蚍磻?yīng)體系，37 ℃水浴10 min，用分光光度計(jì)在593 nm波長處測(cè)吸光度[32]。以FeSO4的物質(zhì)的量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品的測(cè)定：取1 mL樣品于試管中，再加入5 mL的FRAP試劑，振蕩混勻并在37 ℃條件下水浴10 min，用分光光度計(jì)測(cè)定593 nm波長處的吸光度。以蒸餾水代替樣品做空白調(diào)零；以蒸餾水代替氯化鐵溶液做干擾實(shí)驗(yàn)吸光度記做A2；樣品的吸光度為A1；樣品抗氧化能力的（FRAP值）是以每毫克樣品達(dá)到相同吸光度（A1—A2）所需FeSO4的物質(zhì)的量表示。

1.2.6.4 超氧陰離子自由基（O2—·）清除率的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定O2—·清除活性。取超聲提取后的上清液分別稀釋到相應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（分別按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60稀釋）得到樣品溶液，取2.6 mL Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.20，0.05 mol/L，用2 mmol/L乙二胺四乙酸配制）與0.2 mL樣品溶液混合，振蕩混勻并于25 ℃保溫10 min，最后加入25 ℃預(yù)熱過的鄰苯三酚溶液0.2 mL（3 mmol/L，用10 mmol/L HCl溶液配制）迅速搖勻后倒入比色皿中，用分光光度計(jì)在321 nm波長處測(cè)定一次吸光度，每隔30 s測(cè)定一次3 min后停止，計(jì)算鄰苯三酚的自氧化速率[33-34]，根據(jù)鄰苯三酚的自氧化速率計(jì)算抑制率，用式（4）計(jì)算清除O2—·清除率：

式中：V0為對(duì)照管吸光度隨時(shí)間的變化率；VS為樣品管吸光度隨時(shí)間的變化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 河蜆肉基礎(chǔ)成分

經(jīng)測(cè)定，河蜆肉中蛋白質(zhì)含量為6.87%，總糖含量為3.37%，水分含量為89.02%，灰分含量3.37%。去除水分含量以干質(zhì)量計(jì)河蜆肉中的蛋白質(zhì)為62.57%，總糖含量為30.69%。所以河蜆肉中有豐富的蛋白質(zhì)和糖。

2.2 超聲波輔助提取河蜆?biāo)艿鞍椎膯我?素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实挠绊?/p>

圖1 料液比對(duì)河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实挠绊慒ig.1 Effects of solid to liquid ratio on the extraction yield of watersoluble proteins from Corbicula fl uminea

由圖1可以看出，水溶性蛋白提取率隨著提取液用量的增加逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶25（g/mL）時(shí)，達(dá)到最大值；與料液比為1∶20之后的試驗(yàn)結(jié)果無顯著性差異，即料液比為1∶20以后，隨著提取液用量的增加，蛋白質(zhì)提取率的變化不顯著。這是因?yàn)樘崛∫河昧吭龃?，河蜆勻漿與水的接觸面積增大，提高了蛋白質(zhì)擴(kuò)散速度，使蛋白提取率提高。而當(dāng)料液比超過1∶20，蛋白質(zhì)分子之間的吸附作用、蛋白質(zhì)分子與水之間的擴(kuò)散作用趨于平衡，導(dǎo)致蛋白溶出率無顯著變化。因此，在本試驗(yàn)條件下，適宜料液比為1∶20。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实挠绊?/p>

圖2 提取時(shí)間對(duì)河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实挠绊慒ig.2 Effects of extraction time on the extraction yield of water-soluble proteins from Corbicula fl uminea

由圖2可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長，河蜆?biāo)苄缘鞍椎奶崛÷试?0～20 min之間顯著增大，超過20 min增大緩慢，當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)，提取率達(dá)到最大值，之后延長時(shí)間提取率的增加不明顯。這是因?yàn)樵诔晻r(shí)間低于20 min時(shí)，隨著超聲波處理時(shí)間的延長，超聲波空化作用增強(qiáng)，使細(xì)胞破碎程度增大，加速了細(xì)胞內(nèi)部水溶性蛋白的溶出速度，蛋白提取率增大；當(dāng)超聲時(shí)間超過20 min以后，可能是由于細(xì)胞破碎到一定程度，水溶性的蛋白質(zhì)的提取率也達(dá)到平衡。所以，考慮到節(jié)約資源和成本選擇適宜超聲時(shí)間為20 min。

2.2.3 提取溫度對(duì)河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实挠绊?/p>

圖3 提取溫度對(duì)河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实挠绊慒ig.3 Effects of extraction temperature on the extraction yield of water-soluble proteins from Corbicula fl uminea

由圖3可以看出，在溫度30～50 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，水溶性蛋白提取率增大顯著，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最大值，超過50 ℃蛋白質(zhì)的提取率略微下降，這是因?yàn)殡S著溫度的升高，蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度加快，有利于蛋白質(zhì)分子分離出來，而溫度超過50 ℃，蛋白質(zhì)可能部分發(fā)生凝膠作用而沉淀，使提取率下降。所以選擇適宜提取溫度為50 ℃。

2.2.4 超聲功率對(duì)河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实挠绊?/p>

圖4 超聲功率對(duì)河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实挠绊慒ig.4 Effects of ultrasound power on the extraction yield of watersoluble proteins from Corbicula fl uminea

由圖4可以看出，在超聲功率小于800 W時(shí)，水溶性蛋白的提取率呈現(xiàn)顯著的升高趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率為800 W時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最大值。這是因?yàn)殡S著超聲波功率的增大，空化作用和機(jī)械作用越強(qiáng)烈，分子擴(kuò)散速度也就越大[32]，蛋白質(zhì)分子滲出越快，蛋白溶出量增大；而當(dāng)超聲功率達(dá)到1 000 W時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率無顯著變化，并且在高功率提取時(shí)對(duì)儀器的損耗較大。因此，選擇800 W為最佳提取功率。

2.3 超聲波提取河蜆?biāo)苄缘鞍醉憫?yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響較大的3 個(gè)因素：提取溫度、提取時(shí)間和超聲功率為考察對(duì)象，以蛋白質(zhì)的提取率為指標(biāo)，采用Design Expert v7.1.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。

表1 超聲波提取河蜆?biāo)艿鞍醉憫?yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table1 Experimental design and results for response surface analysis

表2 響應(yīng)面二次模型方差分析Table2 Analysis of variance for the developed regression model

由表2方差分析結(jié)果表明，溫度、時(shí)間和功率3 個(gè)因素方差分析顯示，時(shí)間和功率均對(duì)提取率具有極顯著的影響，溫度影響不顯著，3 個(gè)因素影響大小排序?yàn)楣β剩緯r(shí)間＞溫度；交互相中，提取溫度與超聲功率交互項(xiàng)和提取時(shí)間與超聲功率交互項(xiàng)對(duì)提取率影響極顯著。二次項(xiàng)中，溫度和功率項(xiàng)均影響極顯著。說明響應(yīng)值Y的變化相當(dāng)復(fù)雜，各個(gè)具體的試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。利用Design Expert軟件對(duì)該模型進(jìn)行分析建立二次響應(yīng)面回歸模型為：Y=—261.71＋6.34A＋5.50B＋0.26C—0.016AB—0.001 6AC—0.002 2BC—0.047A2—

0.061 B2—6.95×10—5C2，該模型回歸項(xiàng)P值小于0.01，失擬項(xiàng)P值大于0.05，說明回歸效果高度顯著，失擬項(xiàng)不顯著，表明該方程擬合3 個(gè)參數(shù)與提取率之間的關(guān)系是可行的；且該模型R2=97.37%，=93.99%，說明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可用于該反應(yīng)的理論推測(cè)。

圖5為固定超聲功率為800 W的情況下，不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間條件下河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实淖兓闆r。在超聲時(shí)間15～25 min時(shí)變化步長為2 min；超聲溫度40～60 ℃時(shí)變化步長為5 ℃的等高線圖可以看到，提取時(shí)間不變，河蜆?biāo)苄缘鞍椎奶崛÷孰S著提取溫度升高呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。以25 min為例，提取溫度在40～50 ℃之間，河蜆?biāo)苄缘鞍椎奶崛÷手饾u增大；反應(yīng)溫度升高至50 ℃左右，河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷蔬_(dá)到較大值；但當(dāng)反應(yīng)溫度再升高，河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷史炊陆?；提取溫度不變時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，河蜆?biāo)苄缘鞍椎奶崛÷手饾u增大。

圖5 溫度和時(shí)間對(duì)河蜆蛋白提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of extraction temperature and time on the extraction yield of Corbicula fl uminea proteins

圖6為固定超聲時(shí)間為20 min的情況下，不同反應(yīng)溫度和超聲功率下河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实淖兓闆r。在超聲功率600～1 000 W，變化步長為80 W；超聲溫度為40～60 ℃，變化步長為5 ℃的等高線圖中可以看到，提取時(shí)間不變，河蜆?biāo)苄缘鞍椎奶崛÷孰S著提取溫度升高呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。以超聲功率為800 W為例，溫度在40～50 ℃之間，河蜆?biāo)苄缘鞍椎奶崛÷手饾u增大；反應(yīng)溫度增大至50 ℃左右，河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷蔬_(dá)到較大值；但當(dāng)提取溫度再升高，河蜆蛋白提取率反而下降；提取溫度保持不變，隨著超聲功率的增大，河蜆?biāo)苄缘鞍椎奶崛÷手饾u增大。

圖7 超聲功率和時(shí)間對(duì)河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷视绊懙捻憫?yīng)曲面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the effects of extraction time and ultrasonic power on the extraction yield of Corbicula fl uminea proteins

圖7 為固定溫度為50 ℃的情況下，不同反應(yīng)時(shí)間和超聲功率下河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛÷实淖兓闆r。在超聲功率為600～1 000 W，變化步長為80 W；超聲時(shí)間為15～25 min，變化步長為2 min的等高線圖中可以看到，河蜆?biāo)苄缘鞍椎奶崛÷屎统暪β室约俺晻r(shí)間呈正相關(guān)。

綜合考慮各種因素的相互作用，通過軟件分析，得出最優(yōu)提取條件為：時(shí)間23 min、溫度48 ℃、超聲功率920 W，在此條件下河蜆?biāo)苄缘鞍椎奶崛÷蕿?7.83%。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，此最優(yōu)條件下河蜆?biāo)苄缘鞍椎奶崛÷?7.70%，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)偏差在0.19%左右，證明在實(shí)踐中應(yīng)用該模型進(jìn)行預(yù)測(cè)是可行的。

2.4 河蜆?biāo)苄缘鞍滋崛∫嚎寡趸钚?/p>

以上最佳提取工藝所得提取液經(jīng)5 000 r/min離心20 min，取上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，測(cè)定其濃縮液中總蛋白含量為0.52%，總糖含量為0.57%。經(jīng)冷凍干燥得河蜆干粉測(cè)其總蛋白含量為37.52%，總糖含量為41.22%。

2.4.1 DPPH自由基清除率

圖8 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)提取液對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.8 DPPH free radical scavenging capacity of Corbicula fl uminea extract

如圖8所示，隨著提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸增大，在提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.054%～0.09%范圍內(nèi)，對(duì)DPPH自由基的清除率顯著增大。當(dāng)提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.09%之后，提取液對(duì) DPPH自由基的清除能力增加緩慢，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析表明，各質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間清除DPPH自由基能力的差異均顯著，在一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)清除能力與質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。

2.4.2 ·OH清除率

圖9 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)提取液對(duì)·OH的清除作用Fig.9 Hydroxyl radical scavenging capacity of Corbicula fl uminea extract

如圖9所示，隨著提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，對(duì)·OH的清除率先增大后減小，河蜆提取物清除·OH的能力并不表現(xiàn)出劑量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）-效應(yīng)關(guān)系。提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.034%時(shí)，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，對(duì)·OH的清除作用逐漸增大，當(dāng)提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.034%時(shí)，河蜆提取液清除·OH的能力達(dá)到最大值（26.33%），之后·OH清除能力隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而減弱。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析表明，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.023%和0.045%時(shí)無顯著差異。

2.4.3 鐵離子還原力

根據(jù)FeSO4的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的線性方程為y= 0.003 7x＋0.008 3（R=0.999 5）。提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鐵離子的還原力如圖10所示，在593 nm波長處吸光度越高表明河蜆提取物的還原能力越強(qiáng)，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，吸光度明顯增大，說明河蜆提取物對(duì)鐵離子還原力的大小與其質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在明顯的依賴關(guān)系。

圖10 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)提取液的還原力Fig.10 Reducing power of Corbicula fl uminea extract

圖11 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)提取液對(duì)·的清除作用Fig.11 Superoxide anion radical scavenging activity of Corbicula fl uminea extract

3 結(jié) 論

以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)確定超聲提取河蜆?biāo)艿鞍椎牧弦罕?、溫度、時(shí)間、超聲功率的最適范圍。通過Box-Behnken試驗(yàn)得到提取率與溫度（A）、時(shí)間（B）、功率（C）關(guān)系的回歸模型，回歸方程為：提取率=—261.71＋6.34A＋5.50B＋0.26C—0.016AB—0.0016AC—0.0022BC—0.047A2—0.061B2—6.95×10—5C2。超聲提取河蜆?biāo)艿鞍椎淖罴烟崛」に嚍椋毫弦罕?∶20、提取時(shí)間23 min、提取溫度48 ℃、超聲功率920 W，在此條件下提取率達(dá)到最大值為67.70%。河蜆提取液具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基、·的能力和較強(qiáng)的鐵離子還原能力，而清除·OH的能力較弱。

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Water-Soluble Proteins from Corbicula fl uminea Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction Process by Response Surface Analysis and Antioxidant Potential

YANG Yuluan YUAN Meilan CHEN Lili BAI Chunqing ZHAO Li*′SHI Ling SU Wei
(National R&D Branch Center for Freshwater Fish Processing College of Life Science Jiangxi Science and Technology Normal University Nanchang 330013′China)

Ultrasound-assisted extraction was adopted to extract water-soluble proteins (WSP from Corbicula fl uminea The optimization of four extraction parameters including solid to liquid ratio extraction time extraction temperature and ultrasound power for the enhanced yield of water-soluble proteins was carried out using Box-Behnken design (BBD and response surface methodology (RSM). Moreover the antioxidant pot ential of WSPs from Corbicula fl uminea was investigated The optimal extraction conditions that provided maximum WSP yield (67.70%) were determined as follows solid to liquid ratio′1:20; extraction time′23 min extraction temperature′48 ℃; and ultrasonic power′920 W The analysis of variance (ANOVA showed that the effects of extraction time and ultrasound power on WSP yield were significant The cells were broken more significantly by ultrasonic cavitation and vibration to fully expose the target product to the solvent accordingly increasing the extraction efficiency and shortening the extraction time Thus the application of ultrasonic is of great significance for water-soluble protein extraction The scavenging activity against 1′1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH and superoxide anion radicals and ferric ion reducing power of the extracts were strong but the hydroxyl radical scavenging activity was weak.

Corbicula fl uminea proteins ultrasound extraction antioxidant activity

TS254.4

A

1002-6630（2015）06-0096-07

10.7506/spkx1002-6630-201506018

2014-07-09

南昌市農(nóng)業(yè)科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（洪財(cái)企[2012]80號(hào)）；江西省教育廳科技重點(diǎn)項(xiàng)目（GJJ12582）

楊玉孌（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：yangyuluan1@126.com

*通信作者：趙利（1967—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：lizhao618@hotmail.com