化膿性汗腺炎一家系γ－分泌酶基因突變檢測

劉 勇徐浩翔惠 云張曉峰肖學敏李誠讓?王寶璽?

·論著·

化膿性汗腺炎一家系γ－分泌酶基因突變檢測

劉 勇1＃徐浩翔2，3＃惠 云4張曉峰2，3肖學敏2，3李誠讓2，3?王寶璽2，3?

目的: 檢測一化膿性汗腺炎(HS)家系γ－分泌酶基因亞基(PS－1，PENEN－2，APH－1，NCSTN)的突變。方法: 提取一化膿性汗腺炎家系及50名無親緣關系的健康對照血DNA，采用PCR技術擴增PS－1、PENEN－2、APH－1和NCSTN基因的全部外顯子，經(jīng)測序、比對確定致病基因突變位點。結果: 該家系HS患者均存在NCSTN c.1300 C＞T(p.R434X)突變，而該家系正常成員及50名健康對照者未發(fā)現(xiàn)該突變，檢索NCBI網(wǎng)站單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫亦未發(fā)現(xiàn)該突變。其余3個亞基未檢測到突變位點。結論: NCSTN基因c.1300C＞T突變可能是該家系的致病基因位點。

反常性痤瘡； 基因突變； γ－分泌酶基因

化膿性汗腺炎(hidradenitis suppurativa，HS)，又名反常性痤瘡，是一種好發(fā)于頂泌汗腺分布部位的炎癥性皮膚病，國外報道其發(fā)病率為0.2%～4%，屬于顯性遺傳性皮膚病，伴不完全外顯率，約三分之一的HS患者有家族史。Wang等首先發(fā)現(xiàn)本病與γ－分泌酶的突變相關。1γ－分泌酶(γ－secretase)是一種跨膜蛋白，由4個亞基1∶1∶1∶1組成，它們分別為早老素－1 (presenilin－1，PS－1)、早老素增強子－2(presenilin enhancer－2，PENEN－2)、前咽缺陷因子(anterior－pharynx－defective－1，APH－1)和NCSTN(nicastrin)。我們新近收集到一個HS家系，對該家系成員進行了γ－分泌酶不同亞基的突變檢測，現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 先證者，男，29歲。13歲時面部出現(xiàn)綠豆大紅色硬結，輕度疼痛，偶化膿，愈合后留下凹陷性瘢痕，并在腋下、臀部、腹股溝等處出現(xiàn)類似皮損，以“痤瘡、毛囊炎”等給予“消炎藥”等治療，效果欠佳。10多年來，病情遷延，皮損愈合后多留下瘢痕。皮膚科情況:面部可見較多凹陷性細小瘢痕，散在綠豆大丘疹、結節(jié)，軀干、腋下散在黃豆至蠶豆大、淡紅色結節(jié)，壓痛(＋)，無膿性分泌物(圖1A)；臀部可見數(shù)枚大小不等的瘢痕伴色素沉著(圖1B)。

患者皮損符合HS的診斷標準:2(1)典型皮損:初期皮損為深在性、痛性結節(jié)(未破潰的癤腫)，后期為膿腫、竇道、瘢痕形成及黑頭粉刺；(2)典型部位:腋窩、臀部、腹股溝、肛周、乳房下等皺褶部位；(3)慢性和復發(fā)性。故診斷為化膿性汗腺炎。家族中可見多位患者(圖2)。

圖1 先證者腋窩(A)和臀部(B)皮損

圖2 反常性痤瘡家系圖

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA制備 本研究獲得中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院倫理委員會批準，在獲得知情同意書的基礎上，分別抽取先證者(III 1)、家系成員(II 1、II 3、II 5、III 2)及50名家系以外的正常人外周靜脈血5 mL，2%乙二胺四乙酸抗凝，用全血基因組DNA提取試劑盒(美國Promega公司)提取外周血DNA，實驗步驟按說明書進行。

1.2.2 PCR擴增目的基因以及DNA測序 引物設計與合成:根據(jù)NCSTN、PSEN－1、PSENEN－2、APH－1基因的所有外顯子設計引物，擴增患者及50名正常對照的上述基因的外顯子及側翼序列(引物序列見參考文獻1)。

PCR條件:反應體系50μL:Mix(為dNTP、Taq酶和緩沖液的混合物)25μL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL，加入ddH2O補足50μL。所有外顯子均選用單循環(huán)PCR方法擴增。反應條件:95℃預變性3 min，進行以下14個循環(huán):95℃變性30 s，63℃退火45 s(以后每個循環(huán)退火溫度減少0.5℃)，72℃延伸75 s，接著進行27個循環(huán):95℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸75 s；共41個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR產(chǎn)物。所有PCR擴增產(chǎn)物純化后送至英濰捷基(上海)公司測序，采用ABI 3730全自動DNA測序儀進行序列測定，測序結果用BLAST軟件比對分析。

2 結果

先證者 PSEN1、NCSTN、PSENEN和APH1所有外顯子采用PCR擴增，其產(chǎn)物經(jīng)測序比對后發(fā)現(xiàn)，NCSTN基因第11號外顯子存在c.1300 C＞T(p. R434X)無義突變(圖3)，隨后在該家系其他成員中測序該外顯子，發(fā)現(xiàn)所有患者均存在該突變，而該家系正常成員未發(fā)現(xiàn)。再檢測50名健康對照者未發(fā)現(xiàn)該突變，查詢美國國家生物技術信息中心(NCBI)網(wǎng)站單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫，未發(fā)現(xiàn)該突變。

圖3 NCSTN基因測序圖

3 討論

HS是一種慢性、復發(fā)性、炎癥性皮膚病，以腋下、腹股溝、會陰、臀部等部位出現(xiàn)炎性丘疹、囊腫、結節(jié)、膿腫、竇道和瘢痕形成為特征，部分皮損疼痛明顯且伴惡臭氣味，給患者帶來極大的痛苦。由于HS早期主要表現(xiàn)為毛囊上皮增生導致的毛囊口閉塞，發(fā)病機制與痤瘡類似，汗腺的損害是受累于毛囊而非原發(fā)的，所以，現(xiàn)在本病常稱之為反常性痤瘡。3，4

本病病因復雜，遺傳因素、細菌感染、免疫功能改變、性激素等多種因素參與了HS的發(fā)病。在HS的遺傳研究方面，我國學者位于世界前列。2006年，Gao等報道了對一個漢族HS家系進行全基因組掃描，將致病基因位于1p21.1－1q25.3。5隨后，宿斌等對2個 HS漢族家系進行研究，在染色體 19q13.1－19q13.3定位了一個新的致病基因位點。由于上述區(qū)域中基因數(shù)目龐大，研究者未能最終確定致病基因。但是，Al－Ali對2個HS大家系進行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)HS致病基因不與1號染色體連鎖。6直到Wang等首次提出家族性AI的發(fā)病是由γ－分泌酶不同亞單位的基因突變引起的。1這一研究結果被國內(nèi)外學者認

同并進一步證實。7－11目前，國內(nèi)外學者報道的與 HS相關的γ－分泌酶突變主要出現(xiàn)在NCSTN亞基。

我們對該三代含有4例患者的HS家系γ－分泌酶的PS－1、PENEN－2、NCSTN和APH－1亞基的外顯子檢測發(fā)現(xiàn)，NCSTN亞基第11號外顯子出現(xiàn)了 c. 1300 C＞T(p.R434X)無義突變，正常健康對照及SNP數(shù)據(jù)庫未發(fā)現(xiàn)該突變，說明該突變是HS新的致病性突變。這一突變導致第434位的精氨酸變?yōu)榻K止密碼子，引起其后大片段氨基酸缺失，對該基因編碼的蛋白NCSTN結構完整性產(chǎn)生影響，進而可能影響γ－分泌酶發(fā)揮正常功能，從而導致HS臨床表型的出現(xiàn)。該突變位點與Miskinyte等報道的法國患者中出現(xiàn)的NCSTN突變一致，12這也是目前報道的唯一的、不同人種中出現(xiàn)的NCSTN基因相同位點出現(xiàn)的相同突變，該突變是否為熱點突變，仍有待于進一步驗證與研究。

總之，在本研究調(diào)查的家系中，NCSTN亞基出現(xiàn)的無義突變?yōu)樾峦蛔?，這為更好的認識并探索γ－分泌酶基因型與HS患者臨床表現(xiàn)之間的聯(lián)系奠定了基礎。

志謝:感謝廣州市皮膚病防治所葉興東主任醫(yī)師對本文家系資料收集給予的幫助。

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6Al－Ali FM，Ratnamala U，Mehta TY，et al.Hidradenitis suppurativa(or Acne inversa)with autosomal dominant inheritance is not linked to chromosome 1p21.1－1q25.3 region.Exp Dermatol，2010，19(9):851－853.

7 Liu Y，Gao M，Lv YM，et al.Confirmation by exome sequencing of the pathogenic role of NCSTN mutations in acne inversa (hidradenitis suppurativa).J Invest Dermatol，2011，131(7): 1570－1572.

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12Miskinyte S，Nassif A，Merabtene F，etal.Nicastrinmutations in French families with hidradenitis suppurativa.J Invest Dermatol，2012，132(6):1728－1730.

(收稿:2014－09－17 修回:2014－10－30)

Mutations in subunits ofγ－secretase gene in one fam ily with hid radenitis suppurativa

LIU Yong，XU Hao-xiang，HUIYun，et al.Department of Dermatology，Xinjiang Uygur Autonomous Region Peoples Hospital，Urumqi，830002

Objective:To identify mutations in subunits(PS－1，PENEN－2，APH－1 and NCSTN)ofγsecretase gene in one family with hidradenitis suppurativa(HS).M ethods:Genomic DNA was extracted from the peripheral blood of the family and 50 healthy controls.All the exons of PS－1，PENEN－2，APH－1 and NCSTN were amplified by PCR.Direct sequencing was performed to screen themutations in those genes.Results:Onemissensemutation(c.1300 C＞T，p.R434X)in NCSTN was identified in all patients，which was not found in healthy members of the family，controls and nucleotide polymophism(SNP)database of NCBI. There were nomutations in PS－1，PENEN－2，APH－1.Conclusion:Themutation in NCSTN ofγ－secretase genemay be associated with HS in this family.

hidradenitis suppurativa；genemutation；γ－secretase gene

國家自然科學基金(編號:81101207，81472905)教育部高校博士點基金(編號:20111106120052)中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金＆北京協(xié)和醫(yī)學院青年基金(編號:3332013056)楊森科研基金(編號:JRCC2011－皮－01)

1新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科，烏魯木齊，830002 2中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院(研究所)，江蘇南京，210042 3江蘇省皮膚性病分子生物學重點實驗室，江蘇南京，210042 4南京軍區(qū)總醫(yī)院皮膚科，江蘇南京，210002＃共同第一作者?通信作者