白藜蘆醇對(duì)HaCaT細(xì)胞ABCA12蛋白表達(dá)的影響

李 軍 陳謹(jǐn)萍 吳 伽

·論著·

白藜蘆醇對(duì)HaCaT細(xì)胞ABCA12蛋白表達(dá)的影響

李 軍 陳謹(jǐn)萍 吳 伽

目的: 確定白藜蘆醇對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞ABCA12表達(dá)的影響。方法: DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，分別設(shè)空白組、白藜蘆醇處理組和過(guò)氧化氫處理組、聯(lián)合處理組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，Real－time PCR檢測(cè)ABCA12 mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)ABCA12蛋白的表達(dá)。結(jié)果: 空白組、白藜蘆醇處理組、過(guò)氧化氫處理組、聯(lián)合處理組ROS水平分別為14.46±1.24、14.31±0.93、201.82±12.52、76.29±5.76，空白組、白藜蘆醇處理組組間比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)，其它各組間比較差異極為顯著(P＜0.01)。ABCA12 mRNA水平分別為1.00±0.23、2.39±0.58、0.19±0.06、0.73± 0.13，各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。蛋白表達(dá)水平分別為1.00±0.14、1.85±0.30、0.17± 0.04、0.55±0.07，各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論: 氧化應(yīng)激下調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞的ABCA12表達(dá)；白藜蘆醇除了抗氧化作用外，還可以上調(diào)ABCA12的表達(dá)。

白藜蘆醇； ABCA12； 抗氧化

目前在許多皮膚疾病發(fā)病機(jī)制研究中，皮膚屏障功能日益受到關(guān)注。ABCA12(Adenosine triphosphate–binding cassette A12)作為一種ABC家族脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體，位于板層小體包膜，參與板層小體的形成，對(duì)維持正常的皮膚屏障功能起重要作用。1白藜蘆醇具有抗老化、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等一系列生物活性，2，3但在角質(zhì)形成細(xì)胞脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中是否發(fā)揮作用尚無(wú)定論。本實(shí)驗(yàn)建立表皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，通過(guò)白藜蘆醇的干預(yù)來(lái)研究其對(duì)表皮的抗氧化保護(hù)作用，探討白藜蘆醇對(duì)表皮細(xì)胞ABCA12表達(dá)及皮膚屏障功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及來(lái)源 人表皮細(xì)胞系HaCaT，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)液(德國(guó)Biochrom公司)、10%胎牛血清(德國(guó)Biochrom公司)、白藜蘆醇(美國(guó) Sigma公司)、1mmol/L H2O2(美國(guó)Sigma公司)、Trizol(美國(guó) Invitrogen公司)、DNaseI (Rnase Free)(TaKaRa，大連寶生物公司)、SYBR ExscriptTMRT－PCR Kit(TaKaRa，大連寶生物公司)、引物由上海英駿公司合成，DAFC抗體(美國(guó)Sigma公

司)，小鼠抗人 ABCA12、GAPDH一抗(美國(guó) Santa Cruz公司)、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(美國(guó) Santa Cruz公司)、ECL蛋白印跡發(fā)光試劑盒(美國(guó) Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL和鏈霉素100 mg/L。培養(yǎng)條件為37℃含5%CO2飽和濕度孵箱孵育。

1.2.2 HaCaT細(xì)胞系處理及分組 根據(jù)是否采用白藜蘆醇預(yù)先干預(yù)及過(guò)氧化氫處理，設(shè)為4組(每組5例):空白組采用100 μL培養(yǎng)液預(yù)先干預(yù)24 h，繼以100 μL PBS緩沖液處理24 h；白藜蘆醇處理組采用0.25 μmol/L白藜蘆醇預(yù)先干預(yù)24 h，繼以100 μL PBS處理24 h；過(guò)氧化氫處理組采用100 μL培養(yǎng)液預(yù)先干預(yù)24 h，繼以200 μmol/L過(guò)氧化氫處理24 h；聯(lián)合處理組采用0.25 μmol/L白藜蘆醇預(yù)先干預(yù)24 h，繼以200 μmol/L過(guò)氧化氫處理24 h。取處理后細(xì)胞繼續(xù)以下檢測(cè)。白藜蘆醇濃度選擇藥液培養(yǎng)細(xì)胞活性無(wú)明顯降低，且相對(duì)較高的濃度0.25 μmol/L；過(guò)氧化氫濃度選擇半致死濃度200 μmol/L。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)檢測(cè) 調(diào)整細(xì)胞為1×l05個(gè)/孔，接種于培養(yǎng)板，每孔1 mL。同上處理后棄原液，胰酶消化，培養(yǎng)液中和，移入EP管離心3 min (4000 r/min)，棄上清液，每管加入 PBS 800 μL、DAFC抗體0.2 μL，37℃ 30 min溫育，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 總RNA的提取及Real－Time RT－PCR檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。ABCA12特異引物: a1，5'－CCACAAGGAGCATAAGAA－3'；a2，5'－ATACAACCCAGGCGACCA－3'，產(chǎn)物片段258 bp。內(nèi)參照GAPDH特異引物:b1，5'－TCCTCCACCTTTGACGCT－3'；b2，5'－CCACCACCCTGTTGCTGT－3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為103bp。采用20 μL反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 s；95℃變性5 s，56℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 ABCA12表達(dá)的Western blot檢測(cè) 各組細(xì)胞提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，約20 μg總蛋白于6%SDS－PAGE凝膠中4 mA恒流電泳，恒壓100 V將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，含5%脫脂奶粉的PBS封閉液4℃封閉過(guò)夜，加入小鼠抗人ABCA12、GAPDH一抗(稀釋濃度為1∶1000)室溫孵育2 h，PBS洗膜后，加入1∶3000 HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h，PBS洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光劑，生物圖像分析儀(Pharmacia，瑞典)成像，以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行半定量分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料采用ˉx±s表示，組間差異采用單因素方差檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，顯著性水準(zhǔn)α設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 ROS檢測(cè)水平 空白組、白藜蘆醇處理組、過(guò)氧化氫處理組、聯(lián)合處理組各組ROS水平分別為14.46 ±1.24、14.31±0.93、201.82±12.52、76.29±5.76(圖1)?？瞻捉M、白藜蘆醇處理組組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其它各組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 各組表皮細(xì)胞ROS值

2.2 ABCA12的核酸轉(zhuǎn)錄水平 過(guò)氧化氫處理組＜聯(lián)合處理組＜空白組＜白藜蘆醇處理組。空白組、聯(lián)合處理組組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其它各組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.3 ABCA12的蛋白表達(dá)水平 過(guò)氧化氫處理組＜聯(lián)合處理組＜空白組＜白藜蘆醇處理組。各組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。Western blot檢測(cè)見(jiàn)圖2。

表1 各組ABCA12的核酸轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)相對(duì)水平

轉(zhuǎn)錄水平空白組、聯(lián)合處理組組間比較P＞0.05；蛋白表達(dá)空白組、聯(lián)合處理組組間比較P＜0.05，其它各組間兩兩比較P＜0.01

圖2 各組表皮細(xì)胞ABCA12表達(dá)的變化

3 討論

ABCA12位于板層小體包膜，可將葡萄糖基神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)至板層小體，并將其轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)至角質(zhì)形成細(xì)胞表面，參與皮膚脂質(zhì)的形成，故ABCA12在皮膚屏障功能的維持和恢復(fù)過(guò)程中具有重要作用。4，5白藜蘆醇被認(rèn)為能激活SIRTl，具有抗細(xì)胞老化功能，也可激活過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同刺激因子－1α(PGC－lα)，具有重要的抗氧化功能。6，7

在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激的過(guò)氧化氫處理組ROS表達(dá)較空白組明顯增高，ABCA12表達(dá)則下降，說(shuō)明表皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下出現(xiàn)ABCA12表達(dá)下降，可能使皮膚屏障功能降低。聯(lián)合處理組ROS表達(dá)較空白組稍增高，但較過(guò)氧化氫處理組降低，而ABCA12表達(dá)與空白組相差無(wú)幾，說(shuō)明白藜蘆醇可通過(guò)抗氧化保護(hù)作用來(lái)減少ABCA12表達(dá)下降的程度，從而減少氧化應(yīng)激對(duì)皮膚屏障功能的影響。白藜蘆醇處理組ROS表達(dá)較空白組無(wú)明顯變化，ABCA12表達(dá)稍有上升，說(shuō)明在表皮細(xì)胞正常培養(yǎng)狀態(tài)下，白藜蘆醇本身亦可導(dǎo)致ABCA12表達(dá)增高，有助于皮膚屏障功能恢復(fù)。

故此認(rèn)為氧化應(yīng)激導(dǎo)致表皮細(xì)胞ABCA12表達(dá)下降，白藜蘆醇除了通過(guò)抗氧化保護(hù)作用來(lái)上調(diào)ABCA12表達(dá)外，理應(yīng)還存在其他調(diào)控途徑。有研究表明白藜蘆醇能激活A(yù)MP活化蛋白激酶(AMPK)，而AMPK是代謝過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，可上調(diào)NAD＋水平并激活SIRTl和PGC－lα，8目前還難以明確白藜蘆醇是否能直接激活SIRTl和PGC－lα。另外有學(xué)者認(rèn)為白藜蘆醇可激活 cAMP特異性的磷酸二酯酶(PDE)，參與炎性反應(yīng)、脂肪生成、離子通道功能等多項(xiàng)生理活動(dòng)。9，10所以還有諸多白藜蘆醇參與的調(diào)控途徑和方式有待進(jìn)一步研究。

1 Akiyama M.The roles of ABCA12 in keratinocyte differentiation and lipid barrier formation in the epidermis.Dermatoendocrinol，2011，3(2):107－112.

2 Miki H，Uehara N，Kimura A，et al.Resveratrol induces apoptosis via ROS－triggered autophagy in human colon cancer cells. Int J Oncol，2012，40(4):1020－1028.

3 Yuan Y，Xue X，Guo RB，et al.Resveratrol enhances the antitumor effects of temozolomide in glioblastoma via ROS－dependent AMPK－TSC－mTOR signaling pathway.CNS Neurosci Ther，2012，18(7):536－546.

4 Zuo Y，Zhuang DZ，Han R，et al.ABCA12 maintains the epidermal lipid permeability barrier by facilitating formation of ceramide linoleic esters.J Biol Chem，2008，283(52):36624－36635.

5 Jiang YJ，Uchida Y，Lu B，et al.Ceramide stimulates ABCA12 expression via peroxisome proliferator－activated receptor{delta} in human keratinocytes.J Biol Chem，2009，284(28):18942－18952.

6 Yaseen A，Chen S，Hock S，et al.Resveratrol sensitizes acute myelogenous leukemia cells to histone deacetylase inhibitors through reactive oxygen species－mediated activation of the extrinsic apoptotic pathway.Mol Pharmacol，2012，82(6):1030－1041.

7 Hirzel E，Lindinger PW，Maseneni S，et al.Differential modulation of ROS signals and other mitochondrial parameters by the antioxidants MitoQ，resveratrol and curcumin in human adipocytes.J Recept Signal Transduct Res，2013，33(5):304－312.

8 Hong SH，Lee HJ，Sohn EJ，et al.Anti－nephrolithic potential of resveratrol via inhibition of ROS，MCP－1，hyaluronan and osteopontin in vitro and in vivo.Pharmacol Rep，2013，65(4): 970－979.

9 Eo SH，Cho H，Kim SJ.Resveratrol inhibits nitric oxide－Induced apoptosis via the NF－Kappa B pathway in rabbit articular chondrocytes.Biomol Ther(Seoul)，2013，21(5):364－370.

10 Farris P，Krutmann J，Li YH，et al.Resveratrol:a unique antioxidant offering a multi－mechanistic approach for treating aging skin.J Drugs Dermatol，2013，12(12):1389－1394.

(收稿:2014－06－11 修回:2014－08－31)

Effects of resveratrol on ABCA12 expression in HaCaT cells

LI Jun，CHEN Jin-ping，WU Jia.Department of Dermatology，Newborn Screening Center，Guangzhou Women and Children's Medical Center，Guangzhou，510623

Objective:To determine the influence of resveratrol on ABCA12 expression in HaCaT cells. Methods:HaCaT cells cultured in DMEM were divided into the blank group，resveratrol group，hydrogen peroxide group and resveratrol combined hydrogen peroxide group.The level of reactive oxygen species(ROS) was detected by flow cytometry.The level of ABCA12 mRNA was detected by RT－PCR and the expression level of ABCA12 protein was detected by Western blot.Results:The level of ROS in the blank control group，resveratrol group，hydrogen peroxide group and resveratrol combined hydrogen peroxide group was 14.46± 1.24，14.31±0.93，201.82±12.52 and 76.29±5.76 respectively.There was no significant difference between blank group and resveratrol group(P＞0.05).The differences between other groups were highly significant(P＜0.01).The level of ABCA12 mRNA was 1.00±0.23，2.39±0.58，0.19±0.06 and 0.73±0.13 respectively. There was a significant difference among four groups(P＜0.05).The expression level of ABCA12 protein was 1.00±0.14，1.85±0.30，0.17±0.04 and 0.55±0.07 respectively.There was a significant difference among four groups(P＜0.05).Conclusion:Oxidative stress inhibits the expression of ABCA12 in cells.Besides antioxidant protection，resveratrol up－regulate the expression of ABCA12.

resveratrol；adenosine triphosphate－binding cassette A12；antioxidant

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東廣州，510623