支氣管肺泡灌洗液葡聚糖檢測對早期診斷侵襲性肺真菌感染的價值

沈 勇，劉 寶，翁云龍，肖齊俊，黃 鑫

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院急救中心，安徽六安 237005;2.安徽省立醫(yī)院ICU，安徽 合肥 230001)

由于人口老齡化、抗生素濫用、器官移植、腫瘤化療藥物的廣泛使用、ICU危重病人存活時間延長等因素影響，近20年來侵襲性肺部真菌感染的發(fā)病率呈急劇上升態(tài)勢。但現(xiàn)狀是臨床醫(yī)生對患者感染侵襲性肺真菌感染(IPFI)的警惕性不高，致使漏診、誤診、錯失最佳治療時機、住院久、花費大甚至病死率升高;另一現(xiàn)狀是IPFI過診過治現(xiàn)象普遍，其根本原因是臨床上對IPFI至今還沒有簡便準(zhǔn)確的診斷方法。臨床上常根據(jù)傳統(tǒng)實驗室方法做出診斷及治療的決策有明顯的局限性，因為真菌通常會在上呼吸道定植，培養(yǎng)或者涂片陽性不能得出肺部真菌感染的結(jié)論。而血清G試驗及半乳甘露糖(GM)試驗的易受眾多因素干擾，假陽性及假陰性的出現(xiàn)比例較高，且血清G試驗陽性結(jié)果出現(xiàn)時間較遲。近幾年來在診斷侵襲性肺真菌感染方面國外大量試驗研究表明，肺泡灌洗液G試驗比血漿G試驗的敏感度和特異性更高，具更高的診斷價值，而目前國內(nèi)關(guān)于肺泡灌洗液真菌相關(guān)抗原檢測的臨床研究較少。

1 材料與方法

1.1 研究對象 為2011年6月至2013年12月入住六安市人民醫(yī)院急診ICU及重癥醫(yī)學(xué)科的危重癥患者，總計入選病例172例，臨床確診侵襲性肺部真菌感染32例(其中侵襲性念珠菌8例、曲霉菌16例、隱球菌5例、酵母菌3例)，肺部普通細菌感染32例及單純腦外傷無肺部感染32例，另76例是臨床有發(fā)生侵襲性肺真菌感染的高危因素，但入院前兩天通過相關(guān)檢查未能明確診斷為侵襲性肺真菌感染患者。臨床確診真菌感染的標(biāo)準(zhǔn)按照2007年頒布的肺真菌感染診斷及治療專家共識執(zhí)行［1］，具體標(biāo)準(zhǔn)如下:符合宿主發(fā)病危險因素≥1項、具有侵襲性肺真菌感染的臨床特征并具有肺組織病理學(xué)和(或)如下任何一項微生物學(xué)證據(jù):(1)無菌術(shù)下取得的肺組織、胸腔積液或血液標(biāo)本培養(yǎng)有真菌生長，但血液標(biāo)本曲霉或青霉(除外馬尼菲青霉)培養(yǎng)陽性時，需結(jié)合臨床排除標(biāo)本污染的可能;(2)肺組織活檢標(biāo)本、胸腔積液或血液鏡檢直接檢出隱球菌;(3)肺組織標(biāo)本、支氣管肺泡灌洗液(BALF)或痰液用組織化學(xué)或細胞化學(xué)方法染色發(fā)現(xiàn)肺孢子菌包囊、滋養(yǎng)體或囊內(nèi)小體。研究對象入選的條件:(1)平均年齡＞18周歲;(2)家屬或者患者本人簽字同意行纖維支氣管鏡肺泡灌洗檢查;(3)患者同意多次采血行葡聚糖檢測(入選前簽署知情同意書)。研究對象排除條件:(1)患者不能耐受纖支鏡檢查及灌洗;(2)預(yù)計短期內(nèi)死亡病例;(3)患者家屬不同意纖支鏡檢查及反復(fù)采血送檢者;(4)1周內(nèi)進食真菌類如香菇等菌菇、靈芝和冬蟲夏草等保健品者，以及接受香菇多糖和磺胺類藥物治療者。

1.2 技術(shù)路線 具體分組:肺真菌感染高風(fēng)險患者即刻及第2天行相關(guān)檢查，一旦確診即入確診IPFI組，經(jīng)兩次檢查后未能明確診斷者則自動剔除。如患者無真菌感染危險因素，且臨床表現(xiàn)及肺部影像學(xué)、微生物學(xué)檢查無真菌感染證據(jù)，同時細菌感染存在者入普通細菌感染組。選擇單純顱腦損傷患者且無肺部感染證據(jù)者為無肺部感染組。76例有基礎(chǔ)疾病危險因素或有肺部感染證據(jù)但早期(入院后前2 d)未能明確診斷為真菌感染者每日(連續(xù)5 d)行相關(guān)培養(yǎng)、鏡檢、實時PCR及影像學(xué)檢查直至明確是否真菌感染，76例均符合宿主發(fā)病危險因素≥1項，且具侵襲性肺真菌感染的臨床特征并具有肺典型影像學(xué)和(或)任一項微生物學(xué)證據(jù)即為確診或者臨床診斷成立定義為診斷組，經(jīng)過5 d檢查仍不能明確病原體者自動剔除;住院期間一直未行抗真菌治療，但經(jīng)過普通抗細菌治療臨床預(yù)后改善者定義為排除組。

全部研究對象入組后首先進行胸部CT檢查，明確肺部感染病灶的具體位置后，以此確定纖支鏡檢查的目標(biāo)段或亞段支氣管。各組患者每日行肺泡灌洗液及抽靜脈血留取血漿行葡聚糖檢測，同時留取患者血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白等相關(guān)試驗室檢查指標(biāo)。研究對象一旦確診IPFI即給予根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果選擇的針對性抗真菌藥物治療。

1.3 肺泡灌洗液及血漿標(biāo)本采集后進行葡聚糖檢測試驗 檢測原理:應(yīng)用雙抗體夾心法原理。鱟試驗檢測法檢測(1，3)-β-D葡聚糖水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用 SPASS16.0軟件進行處理，所得計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，三組間采用單因素方差分析，兩組間采用獨立樣本t檢驗的方法，比較各組是否有統(tǒng)計學(xué)差異，取P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。繪制ROC曲線，確定肺泡灌洗液及血漿兩種標(biāo)本G實驗診斷肺侵襲性真菌病的最佳臨界值。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般資料 入選研究對象患者共172例，其中確診肺部真菌感染組、普通細菌感染組及無肺部感染組各32例。另有符合以下條件:(1)患真菌感染的高風(fēng)險因素之一包括實體器官移植、血液系統(tǒng)惡性腫瘤、長期化療及接受糖皮質(zhì)激素治療等;(2)診斷為肺部感染，但入院前2 d未明確病原體，稱未明確組患者共76例。收集研究對象的一般生理學(xué)數(shù)據(jù)見表1。

2.2 IPFI組、普通感染組、無感染組患者 BALF及血漿BG水平比較 三組患者肺泡灌洗液及血漿葡聚糖濃度見表2及圖1，IPFI組BALF BG濃度最高，均值為(589.94 ±317.17)ng·L－1，其次為普通感染組為(112.28 ±61.86)ng·L－1，各組之間數(shù)值比較均有統(tǒng)計學(xué)差異;IPFI組血漿BG濃度最高，均值為(346.13 ±214.06)ng·L－1，其次為普通感染組為(70.88 ± 47.18)ng·L－1，各組之間數(shù)值比較均有統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 研究對象一般生理學(xué)數(shù)據(jù)

表2 三組患者肺泡灌洗液及血漿葡聚糖濃度比較

2.3 76例入院時未確診組患者最后診斷情況及參數(shù)比較 76例入院時未確診IPFI病例在隨后的5 d檢查中有29例明確診斷及臨床診斷為侵襲性肺真菌感染(其中BALF直接鏡檢見隱球菌2例，兩次及以上鏡檢見可疑曲霉菌和酵母菌菌絲分別2例和1例，兩次培養(yǎng)同一念珠菌、新隱球菌、曲霉菌分別8例、5例、11例)，29例因為不能明確病原體而剔除，余下18例排除真菌感染。診斷組患者BALF葡聚糖濃度升高均早于血漿濃度升高，其中13例早24 h，而有7例早48 h。診斷組BALF BG濃度明顯高于排除組(表3)，BALF BG濃度為149.5 ng·L－1時的約登指數(shù)值最大，為0.87，預(yù)測IPFI的敏感性為96.6%，特異性為 90.48%(AUC=0.982，P ＜0.001)(圖2)。診斷組血漿BG測得水平也顯著高于排除組(表3)，血漿BG濃度為81 ng·L－1時約登指數(shù)最大，為0.81，預(yù)測 IPFI的敏感性為96.6%，特異性為85.7%(AUC=0.982，P ＜0.001)(圖3)。

3 討論

并發(fā)侵襲性肺真菌感染是致實體器官移植及血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者死亡的主要原因［2］。最近的數(shù)據(jù)顯示重癥醫(yī)學(xué)科患者發(fā)生真菌性肺部感染的比例呈增高趨勢［3］，早期的尸體活檢顯示重癥病房醫(yī)生往往對肺真菌感染的幾率認識不足［4］，越來越多的研究顯示慢性阻塞性肺病、肝硬化、接受糖皮質(zhì)激素治療患者等均為發(fā)生侵襲性肺部真菌感染的高危因素，此外長期標(biāo)準(zhǔn)化療程聯(lián)合應(yīng)用多種抗結(jié)核藥的老年患者呼吸道真菌二重感染的幾率甚至達到35.1%。為了提高臨床醫(yī)生對此疾病的認識，國內(nèi)外近幾年均出版了侵襲性肺部真菌感染診療相關(guān)指南，這又導(dǎo)致臨床上過度診斷、過度治療的問題。故此類患者保障治療成功和降低治療費用及藥物副作用的關(guān)鍵是早期正確診斷出侵襲性肺真菌感染。肺部高分辨率CT上顯示的“暈征”不足以診斷曲霉菌感染［5］，組織活檢是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但一者創(chuàng)傷大且不能被患者家屬及臨床醫(yī)生接受，二者因為準(zhǔn)確取材部位的問題導(dǎo)致活檢陽性率很低。傳統(tǒng)的呼吸道痰培養(yǎng)出真菌方法的敏感性及特異性均僅50%左右，故有近一半的侵襲性肺真菌感染患者會被誤診、漏診［6］。

表3 76例入院時未確診組患者最后診斷情況及參數(shù)比較

葡聚糖是細胞壁的重要成分，約占其干燥重量的80% ～90%。而這其中(1，3)-β-D葡聚糖(BG)占真菌細胞壁成分50%以上，是真菌細胞壁上的大量存在而又特有的抗原成分，其存在形式以(1，3)-β-糖苷鍵連接的葡萄糖殘基骨架作為主鏈，分支狀(1，6)-β-D葡萄糖殘基作為側(cè)鏈。當(dāng)真菌經(jīng)各種途徑進入人體的血液或深部的組織后，經(jīng)組織吞噬細胞的吞噬、消化等處理后，真菌胞壁中可釋放出來游離的BG，從而使血液、組織間液及特定體液中BG含量增高。當(dāng)真菌侵入并存在體內(nèi)含量較少時，機體的免疫系統(tǒng)可將其清除，不造成感染。真菌感染表淺的組織后，表淺組織部位吞噬細胞極少，不會有大量吞噬細胞吞噬處理后釋放出BG，故BG在體液中的量不增高，因而血清G試驗是IPFI的一個重要的診斷依據(jù)。血清G試驗作為一種快速、無創(chuàng)的檢測方法，其在診斷IPFI中的價值已得到肯定［7］。但研究發(fā)現(xiàn)多種因素能影響血清G試驗結(jié)果［8］，并且在肺部真菌感染早期BG尚未釋放入血，故在血清中峰濃度出現(xiàn)較遲，從而影響早期診斷出IPFI［9］。近年來學(xué)者們對動物實驗的研究發(fā)現(xiàn)，肺部被真菌感染動物的肺泡灌洗液中(1，3)-β-D葡聚糖會顯著升高，同時實驗動物感染后l、3、5 d血漿G實驗敏感性分別為58.33%，75%，75%，實驗組感染后1、3、5 d，而肺泡灌洗液的敏感性第1天就達到了75%，第3天進一步升高至83.3%［10］，這項動物試驗提示侵襲性肺真菌感染患者肺泡灌洗液(1，3)-β-D葡聚糖濃度的變化可能比血漿更早、更敏感。國內(nèi)外對此曾有相關(guān)研究報道，但實施批量患者臨床試驗較少。我們的研究結(jié)果顯示IPFI組 BALF(1，3)-β-D 葡聚糖平均濃度為(589.94 ± 317.17)ng·L－1，顯著高于單純肺炎組(112.28 ± 61.86)ng·L－1和非感染組(28.78 ±11.53)ng·L－1，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;IPFI組血漿(1，3)-β-D 葡聚糖平均濃度為(346.13 ±214.06)ng·L－1，顯著高于單純非真菌感染肺炎組(70.88±47.18)ng·L－1和非感染組(13.56 ± 5.19)ng·L－1，差異均有明顯統(tǒng)計學(xué)意義，但單純肺炎非真菌感染組和無肺部感染組比較，差異并無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。因此我們可以得出結(jié)論，BALF G試驗同血漿G試驗一樣，在診斷IPFI方面具有較高的診斷價值。在比較各組患者的血漿與BALF BG濃度發(fā)現(xiàn)，三組患者BALF中BG濃度均顯著高于血漿。初步分析可能的原因包括:(1)行葡聚糖檢測的時間為確診當(dāng)日，此時(1，3)-β-D葡聚糖可能還沒有大量釋放入血，近而導(dǎo)致肺泡灌洗液濃度高于血漿，另外(1，3)-β-D葡聚糖是真菌的細胞壁被破壞釋放產(chǎn)物，并不需要完整的菌體，當(dāng)感染局限于少數(shù)臟器，如肺部，沒有形成真菌血癥，只有少量的BG釋放入血，這就導(dǎo)致血漿G試驗結(jié)果陰性或偏低，而針對病變部位的肺泡灌洗液這種真菌細胞壁破壞后釋放產(chǎn)物較多。(2)真菌只有經(jīng)吞噬細胞的吞噬并消化等處理后，BG從胞壁中釋放出來才能被檢測到。恰恰是肺泡及肺泡液中天然存在著大量吞噬細胞，吞噬并消化真菌后將大量BG成分逐步釋放進支氣管肺泡液中，使BALF標(biāo)本G實驗的敏感性保持在較高水平。我們的研究還發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象，普通感染組血漿與肺泡灌洗液葡聚糖濃度雖然小于確診組，但仍高于無感染組，這其中的可能原因為入住重癥病房的肺部感染患者均為重癥病例，此時大劑量廣譜抗生素導(dǎo)致真菌局部定植可能，從而導(dǎo)致濃度升高，另一個可能的原因是重癥患者使用的藥物比較復(fù)雜，從而干擾了檢測結(jié)果。

通過對入院時有高風(fēng)險因素而未確診肺部真菌感染的76例患者研究發(fā)現(xiàn)，在隨后的5 d檢查中有29例患者被確診或者臨床診斷為侵襲性肺真菌感染(確診7例，臨床診斷22例)。確診及臨床診斷患者肺泡灌洗液葡聚糖濃度升高均早于血漿葡聚糖濃度升高，其中13例早24 h，有7例早48 h。診斷組的BALF BG濃度顯著高于排除組，BALF BG濃度為 149.5 ng·L－1時的約登指數(shù)最大，為 0.87，預(yù)測IPFI的敏感性為96.6%，特異性為90.48%(AUC=0.982，P ＜0.001)。診斷組血漿 BG 濃度顯著高于排除組，血漿BG濃度為81 ng·L－1時的約登指數(shù)值最大，為 0.81，預(yù)測 IPFI的敏感性為96.6%，特異性為 85.7%(AUC=0.982，P ＜0.001)。這再次表明肺泡灌洗液葡聚糖濃度峰值出現(xiàn)時間要早于血漿，利用肺泡灌洗液葡聚糖濃度變化能更早的指導(dǎo)對高?；颊哌M行干預(yù)治療。另外比較兩者的特異性及敏感性發(fā)現(xiàn)，兩者在診斷侵襲性肺真菌感染的敏感性方面無明顯差異，而肺泡灌洗液的特異性要高于血漿，這可能與藥物等干擾因素在肺臟肺泡液中濃度偏小有關(guān)。

綜上所述，BALF的G試驗與血清G試驗相比，具有較高的特異性，同時肺泡灌洗液中葡聚糖峰值出現(xiàn)要早于血漿，有利于早期診斷，而且檢測影響因素相比較少。但本研究的不足之處也比較明顯，一是本研究為單中心，小樣本研究，二是患者在進行支氣管肺泡灌洗時，不同的灌洗量以及不同的灌洗液回收率也會對結(jié)果產(chǎn)生影響，三是因天然細胞壁缺乏BG的接合菌屬，及有莢膜包裹難以釋放BG入血的隱球菌，使G試驗假陰性，進而不能診斷，四是BG抗原的廣譜特異性，不能進一步區(qū)分酵母菌及曲霉菌。

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