Chinese 1基因型弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白R(shí)OP16的基因克隆表達(dá)及生物信息學(xué)分析

唐媛媛，莫緒維，陳 鶴，李 群，蔡亦紅，沈繼龍

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230032;2.安徽省六安市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽六安 237000;3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽合肥 230022;4.安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫系，安徽合肥 230032;5.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，安徽合肥 230032)

剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)隸屬于頂復(fù)門(mén)，是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，可寄生在幾乎所有有核細(xì)胞中，可引起人獸共患弓形蟲(chóng)病，對(duì)人類(lèi)健康和畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的危害。全世界約有1/3人感染弓形蟲(chóng)病，我國(guó)的人群感染率為10%。在弓形蟲(chóng)入侵過(guò)程中，微線體首先釋放出微線體蛋白，微線體蛋白的釋放會(huì)立刻觸發(fā)棒狀體分泌RONs［1］。棒狀體蛋白由蟲(chóng)體前端的分泌器官ROP分泌，在蟲(chóng)體入侵及納蟲(chóng)空泡的形成過(guò)程中起重要的作用。大多數(shù)棒狀體蛋白(ROPs)定位在納蟲(chóng)空泡(parasitophorous vacuole，PV)和納蟲(chóng)空泡膜(parasitophorous vacuole membrane，PVM)上，是弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞以及在宿主細(xì)胞中生存的必要條件［2］;同時(shí)作為一種重要的毒力因子在和宿主細(xì)胞的相互作用中也起到非常重要的作用。目前研究較多的為ROP1和ROP2，其中屬于ROP2家族的ROP2、ROP16、ROP18 具有良好的免疫原性和保護(hù)性［3－4］。在侵入宿主細(xì)胞后，ROP16會(huì)移位到宿主細(xì)胞核中，影響宿主細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(可能參與轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子STAT3和STAT6的調(diào)節(jié)［5］。Murray等在研究中發(fā)現(xiàn)，Type I型弓形蟲(chóng)是通過(guò)ROP16蛋白直接磷酸化STAT3/STAT6誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化;而TypeⅡ型弓形蟲(chóng)ROP16由于其氨基酸序列的503位點(diǎn)由亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸(ROP16 L503S)而使得其無(wú)法有效活化STAT3/STAT6［6］。結(jié)合這些研究成果，本實(shí)驗(yàn)對(duì)流行于我國(guó)的優(yōu)勢(shì)基因型Chinese1基因型弓形蟲(chóng)(Wh3株)ROP16進(jìn)行研究，以期為我國(guó)優(yōu)勢(shì)基因型弓形蟲(chóng)株的研究、弓形蟲(chóng)主要抗原［7］及弓形蟲(chóng)病疫苗的研究奠定基礎(chǔ)［8］。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)小鼠為SPF級(jí)BALB/C小鼠購(gòu)于蘇州工業(yè)園區(qū)愛(ài)爾麥特科技有限公司［動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2014－0007］，6～8周，雌性，體重28～30 g，室溫下自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、衛(wèi)生飲水;Chinese1基因型弓形蟲(chóng)(Wh3株)株，大腸桿菌XL1-blue、BL21 和 DH5α，原核表達(dá)載體 pET-28a，真核表達(dá)載體pEGFP-C2，293T細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保種;引物由上海生物工程有限公司合成;TagDNA聚合酶，高保真PCR酶、dNTP、一步法RT-PCR試劑盒(Roche公司)，限制性?xún)?nèi)切酶 NOT1、ECOR1，Kpn 1，pMD18-T，T4連接酶，PCR產(chǎn)物純化試劑盒，膠回收試劑盒均購(gòu)自大連寶生物(TATARA)公司;小量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)OMEGA公司;HRP標(biāo)記抗小鼠IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;其它試劑系國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 弓形蟲(chóng)速殖子DNA的提取 弓形蟲(chóng)速殖子感染健康小鼠，待小鼠出現(xiàn)明顯的弓背、豎毛、活動(dòng)減少等癥狀時(shí)脫頸處死小鼠，從小鼠腹水中收集弓形蟲(chóng)速殖子，PBS洗滌后計(jì)數(shù)，根據(jù)蟲(chóng)體數(shù)量加入Trizol裂解蟲(chóng)體，提取蟲(chóng)體總RNA，然后經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 弓形蟲(chóng)ROP16基因的體外擴(kuò)增和克隆 參照PUBMED上搜索到的RH株的ROP16基因序列，設(shè)計(jì)原核表達(dá)質(zhì)粒引物:上游引物:5'-gaattcatgaaagtgaccacgaaag-3'，下游引物:5'-gcggccgcctacatccgatgtgaagaaagtt-3';按照pEGFP-C2載體引物設(shè)計(jì)要求，設(shè)計(jì)真核表達(dá)質(zhì)粒引物:上游引物:5'-gaattcatgaaagtgaccacgaaag-3'，下游引物:5'-gggtacccctacatccgatgtgaagaaagtt-3'。以弓形蟲(chóng)基因組DNA為模板，擴(kuò)增弓形蟲(chóng)ROP16基因，反應(yīng)條件為:預(yù)變性2 min，94℃變性30 sec，64℃退火 30 sec，72℃延伸 2 min 30 s，35個(gè)循環(huán);1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T連接，后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-blue感受態(tài)細(xì)胞，菌落經(jīng)PCR和質(zhì)粒DNA序列分析鑒定陽(yáng)性菌株。

1.2.3 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 抽提含正確的插入片段的pMD-T質(zhì)粒和質(zhì)粒pET-28a質(zhì)粒，分別用NOT1、ECOR1進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，將酶切后的載體和目的片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，菌落經(jīng)PCR和雙酶切鑒定。

1.2.4 ROP16基因在大腸埃希菌BL21中的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-28a/ROP16單菌落接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，次日取200 μL于20 mL培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)A600值在0.4左右時(shí)加入IPTG至終濃度為1 mmol·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，后每隔1 h離心收集菌液，超聲波處理，高速離心后分離上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 重組蛋白的免疫反應(yīng)性分析 重組陽(yáng)性菌pET-28a-ROP16和空載體pET-28a轉(zhuǎn)化菌裂解物經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至NC膜，于37℃用BSA封閉2 h，以鼠抗弓形蟲(chóng)血清(1∶50稀釋)為一抗，HRP標(biāo)記抗小鼠IgG作二抗，進(jìn)行Western blot，分析重組蛋白免疫反應(yīng)性。

1.2.6 真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 抽提含有正確插入片段的pMD18-T的質(zhì)粒和 pEGFP-C2質(zhì)粒分別用NOT1、Kpn 1進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切后的目的片段和載體，膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，將酶切后的目的片段和載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落經(jīng)PCR和雙酶切鑒定。

1.2.7 真核表達(dá)質(zhì)粒在293T細(xì)胞中的表達(dá) 采用貼壁細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染法，按脂質(zhì)體LipofectamineTM3000的使用說(shuō)明進(jìn)行。在轉(zhuǎn)染前一天將293T細(xì)胞轉(zhuǎn)入6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至細(xì)胞瓶底70%～80%飽和度且細(xì)胞狀態(tài)良好是進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在無(wú)菌的1.5 mL離心管中準(zhǔn)備下列溶液:溶液A:用無(wú)血清DMEM將4 μg待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA稀釋成250 μL;溶液B:用無(wú)血清DMEM將6 μL脂質(zhì)體 LipofectamineTM3000稀釋至250 μL;合并溶液 A和溶液B，輕輕混勻，室溫孵育20 min，以形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物;將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞換液，用無(wú)血清的DMEM洗滌兩次;向混合液中加入1 mL 37℃預(yù)熱的無(wú)血清DMEM，輕輕混勻，緩慢加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞中;置CO2培養(yǎng)箱中，37℃孵育6 h后棄細(xì)胞上清，加入含10%小牛血清的DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h;置倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.8 RT-PCR法鑒定蛋白在細(xì)胞中的表達(dá) 將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后的細(xì)胞用(PBS)洗滌兩次之后，用Trizol裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增;擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.9 生物信息學(xué)分析 蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的發(fā)揮在很大程度上取決于其三維結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)蛋白的三維結(jié)構(gòu)對(duì)于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析及其功能預(yù)測(cè)都有很好的支持作用;本實(shí)驗(yàn)采用能夠同源建模和從頭合成兩套不同算法I-TASSER預(yù)測(cè)ROP16基因的3D結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究ROP16的結(jié)構(gòu)和功能提供科學(xué)資料［7］。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體的雙酶切鑒定 重組陽(yáng)性菌pET-28a-ROP16經(jīng) NOT1、ECOR1雙酶切，獲得約5.3 kb和2.1 kb兩條帶，大小與載體片段和目的DNA長(zhǎng)度相符(圖1)。

2.2 目的基因測(cè)序結(jié)果 經(jīng)上海生工測(cè)序TgCtwh3的ROP16基因序列擴(kuò)增出2124 bp片段，與RH株ROP16基因序列99%同源;經(jīng)比對(duì)氨基酸序列503位點(diǎn)與RH株的ROP16序列503位點(diǎn)同為亮氨酸(圖2)。

2.3 原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸埃希菌BL21中的表達(dá)將各小時(shí)留取的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌體超聲波破碎后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在約77 kDa處有明顯條帶，重組蛋白分子質(zhì)量大小與預(yù)期一致。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，融合蛋白的表達(dá)量逐漸增加，在37℃1 mmol·L－1IPTG誘導(dǎo)6 h表達(dá)量最高(圖3)。

2.4 原核表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定 Western blot結(jié)果顯示，重組的pET-28a-ROP16蛋白能被鼠抗弓形蟲(chóng)免疫血清識(shí)別，在77 kDa處可見(jiàn)一條識(shí)別條帶(圖4)。

2.5 真核表達(dá)質(zhì)粒在293T細(xì)胞中的表達(dá) 熒光倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞中，說(shuō)明所構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒在293T細(xì)胞中成功表達(dá)(圖5)。

2.6 RT-PCR法鑒定蛋白在細(xì)胞中的表達(dá) 用轉(zhuǎn)有pEGFP-C2-ROP16重組質(zhì)粒、pEGFP-C2空質(zhì)粒的293T細(xì)胞的總RNA作為模板分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，只有轉(zhuǎn)染有pEGFP-C2-ROP16質(zhì)粒的可以擴(kuò)增出約2 100 bp條帶，與ROP16基因片段大小相符(圖6)。

2.7 蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)圖 圖中白色“箭頭”標(biāo)注的為503位點(diǎn)(圖7)。

3 討論

近些年來(lái)通過(guò)不同基因型蟲(chóng)株雜交、基因敲除和轉(zhuǎn)基因弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株實(shí)驗(yàn)證實(shí)弓形蟲(chóng)具有某些特定的毒力因子在誘導(dǎo)活化巨噬細(xì)胞、刺激宿主免疫反應(yīng)上起關(guān)鍵作用［9］。目前已經(jīng)確定的毒力相關(guān)因子包括弓形蟲(chóng)表面抗原(surface antigen，SAG)1、ROP5、ROP16、ROP18、致密顆粒蛋白(dense granule protein，GRA)7、GRA15等。其中 ROP16蛋白是一種具有多態(tài)性的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，同時(shí)具有酪氨酸激酶活性;在弓形蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中由棒狀體釋放進(jìn)入胞質(zhì)，然后迅速進(jìn)入胞核，能夠直接磷酸化STAT3的Tyr705和STAT6的Tyr641殘基［10－11］。如前所述，Type I型(RH 株)弓形蟲(chóng)是通過(guò)ROP16直接磷酸化STAT3/STAT6誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化;而Type II型弓形蟲(chóng)ROP16氨基酸序列的503位點(diǎn)由亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸(ROP16 L503S)而使得其無(wú)法有效活化STAT3/STAT6，可見(jiàn)ROP16蛋白在弓形蟲(chóng)的入侵以及寄生的過(guò)程中起到非常重要的作用。Wh3株屬于Chinese1型弓形蟲(chóng)，是中國(guó)優(yōu)勢(shì)基因型弓形蟲(chóng)株，其毒力與RH株相似。小鼠梯度毒力實(shí)驗(yàn)證實(shí)(資料為本實(shí)驗(yàn)室所有)，接種同樣劑量的速殖子小鼠Wh3株可引起小鼠的死亡時(shí)間略遲于RH株，100個(gè)速殖子均可以導(dǎo)致小鼠100%死亡。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出我們國(guó)家Wh3分離株的 ROP16蛋白，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn) WH3分離株ROP16蛋白序列503位點(diǎn)處為亮氨酸，那么由此猜測(cè)，我國(guó)的WH3分離株也可以直接磷酸化STAT3/STAT6，對(duì)巨噬細(xì)胞的偏移應(yīng)答起到一定的調(diào)控作用;其次本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增TgCtwh3-ROP16基因片段，插入原核載體pET-28a的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)雙酶切、PCR、測(cè)序鑒定確認(rèn)，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a/ROP16，并在大腸埃希菌BL 21中高效表達(dá)，該重組蛋白以可溶的形式存在于超聲裂解的菌液的上清中，Western blot顯示該蛋白能被鼠抗弓形蟲(chóng)血清所識(shí)別，表明其具有免疫原性;再次本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒，利用增強(qiáng)型綠色蛋白(EGFP)報(bào)告基因，產(chǎn)生的熒光較普通綠色熒光蛋白強(qiáng)35倍，大大增強(qiáng)了報(bào)告基因的敏感度［12］;本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該重組質(zhì)粒能夠成功的在293T細(xì)胞中表達(dá)并通過(guò)RT-PCR鑒定結(jié)果正確，但是轉(zhuǎn)染效率不高，約30%左右，分析可能與ROP16基因片段過(guò)大、ROP16蛋白本身屬于毒力因子不利于轉(zhuǎn)染以及轉(zhuǎn)染試劑的選擇有關(guān);接下來(lái)會(huì)嘗試選擇其他轉(zhuǎn)染試劑以及構(gòu)建病毒包裝質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了我國(guó)優(yōu)勢(shì)基因型WH3株的棒狀體ROP16蛋白的原核及真核重組表達(dá)質(zhì)粒，為我國(guó)優(yōu)勢(shì)基因型弓形蟲(chóng)株的免疫特性、致病機(jī)制以及為我國(guó)的弓形蟲(chóng)疫苗的研究打下了一定的基礎(chǔ);其次成功構(gòu)建ROP16基因的3D結(jié)構(gòu)對(duì)于進(jìn)一步深入的生物信息學(xué)分析以及蛋白的功能研究具有一定的導(dǎo)向意義［13］。

［1］Kemp LE，Yamamoto M，Soldati-Favre D.Subversion of host cellular functions by the apicomplexan parasites［J］.FEMS Microbiol Rev，2013，37(4):607 －631.

［2］徐 穎，高 琦，徐前明，等.弓形蟲(chóng)棒狀體頸部蛋白及棒狀體蛋白研究的新進(jìn)展［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2013，29(12):1217－1221.

［3］Yuan ZG，Zhang XX，He XH，et al.Protective immunity induced by Toxoplasma gondii Rhoptry Protein16 against toxoplasmosis in mice［J］.Clinical and Vaccine Immunology，2011，18(1):119 －124.

［4］Yuan ZG ，Zhang XX，Lin RQ，et al.Protective effect against toxoplasmosis in mice induced by DNA immunization With gene encoding Toxoplasma gondii ROP18［J］.Vaccine，2011，29(38):6614 －6619.

［5］Hunter C，Sibley L.Modulation of innateimmunity by Toxoplasma gondii virulence effectors［J］.Nat Rev Microbiol，2012，10(11):766－778.

［6］Murray PJ.Macrophages as a Battlegroundfor ToxoplasmaPathogenesis［J］.Cell Host＆ Microbe，2011(9):445 －447.

［7］郭 凱.弓形蟲(chóng)主要抗原的研究進(jìn)展［J］.蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，37(4):486 －489.

［8］王培園，李 結(jié)，朱興全，等.弓形蟲(chóng)基因工程疫苗研究的新進(jìn)展［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35(3):251 －254.

［9］Jensen KD，Wang Y，Wojno ED，et al.Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation［J］.Cell Host Microbe，2011，9(6):472 －483.

［10］Butcher BA，F(xiàn)ox BA ，Leah M.Rommereim，et al.Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control［J］.PLoS Pathog，2011，7(9):e1002236.

［11］Chen ZW，Gao JM，Huo XX，et al.Genotyping of Toxoplasma gondii isolates from cats in different geographic regions of China［J］.Vet Parasitol，2011，183(1/2):166 － 170.

［12］吳 勇，劉學(xué)剛，郭嘉誠(chéng)，等.VEGFA基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(1):45 －47.

［13］Bai Y，He S，Zhao G，et al.Toxoplasma gondii:Bioinformatics analysis，cloning and expression of a novel protein TgIMP1［J］.Experimental Parasitology ，2012，132(4):458 －464.