正相高效液相色譜法測定多維片類保健食品中維生素A的含量

邢亞東，王玲玲，黃麗丹

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥 230031;2.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051)

維生素A是一種脂溶性維生素，主要存在于動物肝臟、蛋類、奶油和魚肝油中，它是構(gòu)成視覺細(xì)胞中感受弱光的視紫紅質(zhì)組成成分，同時維持骨骼正常生長發(fā)育并促進(jìn)生長與生殖。人體缺乏維生素A，會影響暗適應(yīng)能力，致兒童發(fā)育不良、干眼病、夜盲癥等;過量攝入維生素A則出現(xiàn)皮膚干燥、脫屑和脫發(fā)等癥狀［1］。維生素A為一具共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯，存在多種立體異構(gòu)，其中全反式構(gòu)型生物活性最強(qiáng)。目前，測定維生素A含量主要使用的比色法、熒光分光光度法、反相高效液相色譜法等［2－7］，均為順反合并測定。2010年版《中國藥典》維生素A測定法中首次收入了正相高效液相色譜法［8］，可有效分離順、反構(gòu)型，準(zhǔn)確測定反式維生素A的含量。目前，食品國標(biāo)尚未進(jìn)行相應(yīng)修訂，保健食品企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)多直接套用食品國標(biāo)，原料多為合成品，檢測結(jié)果與其生物活性不對等。本文根據(jù)多維片類保健食品中維生素A原料多采用維生素A醋酸酯干粉(微囊)［9］的特點，針對性地建立了簡單有效的提取方法，進(jìn)而采用正相高效液相色譜法有效分離維生素A的順、反式構(gòu)型，準(zhǔn)確測定其中反式維生素A的含量，方法簡便、快捷、準(zhǔn)確，可有效用于多維片類保健食品中維生素A的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(日本島津 LC－20AD);高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠GL－21C);超聲波清洗器(Elma P180H);電子天平(梅特勒XP205)。

1.2 試藥 正己烷(色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);異丙醇(色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);維生素A對照品(中檢院，供含量測定用，批號:100368－201301。1 g含維生素A醋酸酯343 mg，其中含反式維生素A醋酸酯96.9%);實驗用樣品:新成長快樂牌復(fù)合維生素咀嚼片(批號:2013－11－07)、倍愛牌多種維生素礦物質(zhì)片(成人型)(批號:20130801)、奧諾康多種維生素礦物質(zhì)片(批號:131005)、珠峰牌多種維生素片(中老年型)(批號:20130703、20130728)、珠峰牌多種維生素片(女士型)(批號:20130816、201310701)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex Luna silica(2)(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相:正己烷—異丙醇(99.7∶0.3)，流速:1.0 mL·min－1，檢測波長:325 nm，柱溫:室溫。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取維生素A對照品13.94 mg，置10 mL棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密量取1 mL置50 mL棕色量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液(每mL含反式維生素A醋酸酯9.27 μg)。

2.2.2 供試品溶液制備 取供試品20片，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置15 mL棕色離心管中，精密加水4 mL，40℃超聲15 min，放冷，用正己烷振搖提取3次，每次5 mL，合并正己烷提取液，加無水硫酸鈉脫水后，氮吹濃縮至適量，加正己烷制成每毫升含維生素A 2～4 μg的溶液(按標(biāo)示量折算)，搖勻，即得。

2.3 方法適用性試驗 精密吸取對照品溶液6 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測定，反式維生素A平均峰面積為1 224 213，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)=0.093%，表明儀器精密度良好。

分別吸取對照品溶液、供試品溶液注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定。對照品、供試品色譜中，維生素A順、反式異構(gòu)體均能有效分離。對照品色譜中反式維生素A理論塔板數(shù)為13 493，供試品色譜中反式維生素A理論塔板數(shù)為13 469。液相色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液1、2、4、6、8、10、12、15、20 μL，注入液相色譜儀，按照“2.1”色譜條件測定。以反式維生素A峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，以絕對進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=8 808X－3 800，r=0.999 9。結(jié)果表明，反式維生素A在9.27 ～185.33 ng的范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.5 重復(fù)性實驗 取同一批號的供試品(珠峰牌多種維生素片，批號:20130816)6份，分別制成供試品溶液，依法測定反式維生素A的含量，平均含量為 111.12 μg·g－1，RSD=2.5%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取新制備的供試品溶液分別在0、2、6、9、13、15、16、24 h 進(jìn)行測定，反式維生素 A平均峰面積為694 462，RSD=1.2%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 回收率實驗 精密稱取已知含量的供試品(珠峰牌多種維生素片，批號:20130816，含量:111.12 μg·g－1)約0.1 g，置15 mL 棕色離心管中，共9份，分成3組，每組分別加入 12.1 mg·L－1維生素 A 對照品正己烷溶液 0.8、1.0、1.2 mL，依法制成供試品溶液，按上述色譜條件測定，結(jié)果反式維生素A平均回收率為97.8%，RSD=2.5%，見表1。

表1 維生素A加標(biāo)回收率

2.8 樣品測定 取各供試品，按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，按照“2.1”色譜條件測定反式維生素A的含量;同時，按文獻(xiàn)［2］的反相色譜條件測定順、反式維生素A的合并含量，結(jié)果見表2。

表2 維生素A測定結(jié)果表

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 維生素A醋酸酯為不飽和酯類、呈油狀、易氧化、溶于脂肪或有機(jī)溶劑，不溶于水，難以均勻地添加于固體保健食品中。目前原料生產(chǎn)企業(yè)將其微囊化，提高它的水溶性和穩(wěn)定性，且形態(tài)由油狀變?yōu)榉蹱?，易于均勻分散制成固體制劑［9］。其壁材主要成分是明膠［10］，藉此，本文選擇采用加水40℃超聲使微囊破壁，再用正己烷提取。

3.2 提取方法的考察 分別對加水量、超聲溫度、超聲時間、正己烷萃取次數(shù)等參數(shù)進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示:加水4 mL、40℃超聲15 min、5 mL正己烷萃取3次時，提取效率最高。

3.3 正、反相液相色譜測定結(jié)果比較 將供試品溶液分別采用正、反相高效液相色譜法進(jìn)行測定，結(jié)果:反相色譜法未將維生素A順、反式分離，測定結(jié)果明顯高于正相色譜法。個別供試品中順式維生素A比例較高，正、反相色譜法測定結(jié)果差異較大，因此，有必要將維生素A順、反構(gòu)型分開測定，以便真實反映產(chǎn)品的活性和品質(zhì)。

［1］徐 芳，羅海吉.維生素A對人類健康生活的重要性［J］.分子影像學(xué)雜志，2013，36(1):28 －30.

［2］中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn).GB 5413.9－2010嬰幼兒食品和乳品中A、D、E的測定［S］.北京:中華人民共和國衛(wèi)生部，2010:1－10.

［3］食品衛(wèi)生檢驗方法理化部分(二).GB/T 5009.82－2003食品中維生素A和維生素E的測定［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012:67－74.

［4］唐 婧，鄭勝彪.維生素分析的研究進(jìn)展［J］.科技信息，2011，21(5):490－491.

［5］陳萬勤，王 瑾，黃麗英，等.高效液相色譜法同時測定配方乳粉中7種脂溶性維生素［J］.分析科學(xué)學(xué)報，2013，29(1):109－112.

［6］董愛軍，崔艷華，楊 鑫.高效液相色譜法同時測定秋葵干蔬中的脂溶性維生素 A、E、K3［J］.分析測試學(xué)報，2011，30(8):887－891.

［7］朱 晨，周魯衛(wèi).維生素A含量測定方法比較［J］.食品工業(yè)，2012，33(7):157 －159.

［8］國家藥典委員會.中國藥典(二部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄51.

［9］顏琳琦，戚綠葉，張麗媛，等.HPLC測定保健食品中微膠囊型維生素 A［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2014，31(7):860 －863.

［10］蘭海霞，孫 蕓，燕雪花.微囊的制備方法研究進(jìn)展［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7(1):139 －141.