反相高效液相梯度洗脫法測(cè)定人血漿中丙泊酚濃度

李 莉，李 培

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011)

丙泊酚(propofol)是一速效短效靜脈麻醉藥，又名異丙酚、普魯泊福。由于麻醉效果見(jiàn)效極快、且麻醉后舒適感較好，除應(yīng)用于麻醉誘導(dǎo)和麻醉維持［1－2］外，還廣泛用于無(wú)痛腸鏡、無(wú)痛胃鏡檢查以及無(wú)痛人工流產(chǎn)術(shù)。測(cè)定異丙泊酚血藥濃度，對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要的意義。丙泊酚血藥濃度的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)［1，3－8］、氣 － 質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)［9－10］、液相色譜 － 串聯(lián)質(zhì)譜(LC－MS/MS)［2］。后兩種方法的靈敏度較高、特異性強(qiáng)、所需樣品量少，但儀器設(shè)備較昂貴，難以普及推廣。在高效液相色譜法中，電化學(xué)和二極管陣列［6］檢測(cè)法國(guó)內(nèi)應(yīng)用較少。目前文獻(xiàn)報(bào)道的高效液相色譜法主要有高效液相－紫外檢測(cè)法(HPLCUV)［4，7－8］、高 效 液 相 － 熒 光 檢 測(cè) 法 (HPLCFlu)［1，3，5］。為適應(yīng)臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的需要，本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)內(nèi)標(biāo)、預(yù)處理方法和流動(dòng)相的選擇，研究并建立了用反相高效液相梯度洗脫法測(cè)定人血漿中丙泊酚濃度的方法，這是文獻(xiàn)中首次出現(xiàn)梯度洗脫法測(cè)定血漿中的丙泊酚濃度。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，適用于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－6AD液相色譜儀(北京超越未來(lái)科技發(fā)展有限公司)，ER－128A電子分析天平(A＆DDeompany，TLD，JAPAN);超聲波清洗儀(500 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司);IKA MS3基本型圓周震蕩搖床(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司);TDL－5A菲恰爾離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司);HGC－12A干浴氮?dú)獯蹈蓛x(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司);pH計(jì)(梅特勒一托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2 藥品與試劑 丙泊酚對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào):100806－200801，ID:4H01－51DP，純度99.8%);卡馬西平片(上海中西三維藥業(yè)有限公司);乙腈(色譜純，SIGMA公司);甲醇(色譜純，SIGMA公司);實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水;磷酸二氫鉀(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng));氫氧化四甲基胺(TMAH，10%，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);異丙醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司);環(huán)己烷(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司);正丁醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司);三氟乙酸(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng))。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hanbon Science＆.Technology C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:流動(dòng)相為乙腈/甲醇混合液(乙腈—甲醇按80∶20(V/V)的比例配制，作為有機(jī)相)—水(水相加1%的三氟乙酸調(diào)pH值到4)進(jìn)行二元梯度洗脫，0～7 min(50∶50，V/V)，7 ～9 min(50∶50 ～70∶30，V/V)，9 ～22 min(70∶30，V/V);流速:1.0 mL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng):274 nm;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:40℃。

2.2 溶液配制 (1)丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制:用移液槍精密量取丙泊酚對(duì)照品25 μL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得到500.00 mg·L－1丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。密閉后，于4℃冰箱保存。(2)丙泊酚系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:用移液管精密量取500.00 mg·L－1的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 12.5 mL 于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為250.00 mg·L－1丙泊酚甲醇溶液。依次逐級(jí)稀釋?zhuān)詈蟮玫?500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 mg·L－1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。(3)內(nèi)標(biāo)液的配制:取卡馬西平片劑20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)。精密稱(chēng)取細(xì)粉25 mg置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液5 mL置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。(4)磷酸鹽緩沖液的配制:稱(chēng)量磷酸二氫鉀1.36 g溶于100 mL蒸餾水中，配制成 0.1 mol·L－1。(5)四甲基氫氧化銨固定液的配制:用移液管精密量取10%(W/W)四甲基氫氧化銨溶液4.7 mL于25 mL容量瓶中，用異丙醇稀釋至刻度。

2.3 樣品處理方法 得到的空白全血或含藥全血于3 000 r·min－1低速離心10 min，取上層液即血漿于2 mL離心管中。取空白血漿或含藥血漿1.00 mL于10 mL連蓋離心管中，分別準(zhǔn)確加入50 μL內(nèi)標(biāo)液、l mL 0.1 mol·L－1的磷酸鹽緩沖液，5 mL 環(huán)己烷:正丁醇(95∶5)的混合有機(jī)溶液溶液。渦旋振蕩2 min，于 4 000·min－1低速離心 5 min，取上層有機(jī)相約4.5 mL移至另一離心管中，精密加入TMAH稀釋液50 μL，渦旋振蕩2 min，40℃氮?dú)饬鞔蹈伞＞芗尤?00 μL乙腈溶解殘余物，渦旋振蕩5 min。復(fù)溶后，吸取混合液過(guò)0.22 μm的濾膜后，精密吸取 20 μL，進(jìn)樣分析。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取空白血漿1 mL置10 mL連蓋離心管中，除不加內(nèi)標(biāo)外，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，獲得空白血漿樣品的色譜圖，如圖1A;將一定濃度的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液混合液進(jìn)樣分析，得色譜圖1B;將此混合液加入空白血漿中，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，得色譜圖1C。內(nèi)標(biāo)物和標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間分別為6.2 min和20.8 min;取麻醉手術(shù)患者靜注丙泊酚 (得普利麻，英國(guó)阿斯利康公司)后收集的血漿樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，得色譜圖1D。結(jié)果表明，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾丙泊酚及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，本方法具有較高的專(zhuān)屬性。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 在10 mL的連蓋離心管中分別加入950 μL空白血漿，再加入丙泊酚系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液50 uL，使血藥濃度相當(dāng)于 25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.098 mg·L－1。按“2.3”項(xiàng)下方法操作，以丙泊酚峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值X為橫坐標(biāo)，丙泊酚的血藥濃度C為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，求得回歸方程為C=1.5975X－0.0294(r=0.999 8)。

丙泊酚的血藥濃度在0.098～25 mg·L－1范圍內(nèi)與峰面積有良好的線(xiàn)性關(guān)系。丙泊酚的定量下限為0.098 mg·L－1(S/N=3)。

2.6 精密度及回收率 在950 μL空白血漿中分別加入低、中、高3種濃度的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，使其濃度分別為0.20，1.56，12.50 mg·L－1，每種濃度6份，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，將丙泊酚峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比X代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算丙泊酚血藥濃度，以測(cè)得值與加入值之比計(jì)算方法回收率。以1 d內(nèi)測(cè)得的丙泊酚血藥濃度計(jì)算日內(nèi)精密度，以連續(xù)測(cè)定3 d，每天1次測(cè)得的丙泊酚濃度計(jì)算日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 丙泊酚回收率與日內(nèi)、日間精密度(±s)

表1 丙泊酚回收率與日內(nèi)、日間精密度(±s)

加入量/mg·L－1測(cè)得量/mg·L－1 RSD/%相對(duì)回收率/%日內(nèi)0.20 0.18 ±0.089 5.05 89.68 ±0.049 1.56 1.55 ±0.016 1.13 98.84 ±0.011 12.50 12.23 ±0.40 3.25 98.99 ±0.022日間 0.20 0.17 ±0.013 7.43 89.33 ±0.031 1.56 1.61 ±0.018 1.09 102.98 ±0.011 12.50 11.75 ±0.68 5.79 93.98 ±0.029

3 討論

3.1 內(nèi)標(biāo)的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道多采用麝香草酚藍(lán)［1，5－7，9］為內(nèi)標(biāo)物，偶見(jiàn) 2，4 － 二叔丁基苯酚［3］、卡馬西平［8］、乙基罌粟堿［10］等做內(nèi)標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)最初選取麝香草酚藍(lán)作為內(nèi)標(biāo)，但是通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相比例、更換流動(dòng)相等色譜條件不能實(shí)現(xiàn)同時(shí)將內(nèi)標(biāo)物、丙泊酚、血漿中的內(nèi)源性基質(zhì)分離的目標(biāo)。經(jīng)過(guò)嘗試，最終選取卡馬西平作為內(nèi)標(biāo)。

3.2 樣品預(yù)處理方法的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道的丙泊酚血樣的預(yù)處理方法主要有液液萃取法［4，7，9］和蛋白沉淀法［5－6］。本實(shí)驗(yàn)分別嘗試了用甲醇、乙腈及二者的混合液作為沉淀劑沉淀蛋白，但發(fā)現(xiàn)回收率偏低。在液液萃取方面，嘗試了用環(huán)己烷［4］、環(huán)己烷:正丁醇(95∶5)混合液［7］、氯仿—乙酸乙酯混合液［9］，最終確定萃取劑為環(huán)己烷:正丁醇(95∶5)的混合有機(jī)溶液溶液。

3.3 流動(dòng)相的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道的流動(dòng)相組成有乙腈∶水(60∶40，pH2.3)［1］、乙腈∶水(69∶31，pH 4.0)［3］、甲醇∶水(75∶25)［4］、乙腈∶水(65∶36)［5］、乙腈:0.01 mol·L－1磷酸二氫鉀水溶液(70∶30，磷酸調(diào) pH 值到 4)［6］、乙腈∶水(70∶30，其中水相加 1%的三氟乙酸調(diào) pH 值到 4)［7］、甲醇∶水(68∶32)［8］等。文獻(xiàn)報(bào)道的均為等度洗脫，本實(shí)驗(yàn)原本使用的流動(dòng)相是乙腈∶水(其中水相加1%的三氟乙酸調(diào)pH值到4)進(jìn)行等度洗脫，但是不論怎樣調(diào)整流動(dòng)相比例，均無(wú)法獲得良好的分離效果。當(dāng)有機(jī)相比例較高(超過(guò)50%)時(shí)，血漿中的內(nèi)源性基質(zhì)和內(nèi)標(biāo)集中在前5 min出峰，不能將內(nèi)標(biāo)物與血漿中的內(nèi)源性基質(zhì)分開(kāi);降低有機(jī)相比例雖能將內(nèi)標(biāo)物、丙泊酚、血漿中的內(nèi)源性基質(zhì)分開(kāi)，然而此時(shí)丙泊酚出峰時(shí)間太長(zhǎng)(超過(guò)30 min)。經(jīng)過(guò)反復(fù)的摸索和嘗試，最終確定流動(dòng)相為乙腈/甲醇混合液(乙腈—甲醇按80∶20(V/V)的比例配制，作為有機(jī)相)—水(水相加1%的三氟乙酸調(diào)pH值到4)，進(jìn)行二元梯度洗脫，0 ～7 min(50∶50，V/V)，7 ～9 min(50∶50 ～70∶30，V/V)，9 ～22 min(70∶30，V/V)，在低濃度條件下也可獲得較好的洗脫效果，內(nèi)標(biāo)和藥物出峰時(shí)間合理，色譜峰形理想。這是文獻(xiàn)中首次出現(xiàn)梯度洗脫法測(cè)定血漿中的丙泊酚濃度。本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可以滿(mǎn)足丙泊酚臨床藥動(dòng)學(xué)研究的需要。

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