反相高效液相色譜法測定克霉唑陰道片中克霉唑的含量

李榮華　李瑞明

反相高效液相色譜法測定克霉唑陰道片中克霉唑的含量

李榮華1李瑞明2

目的建立克霉唑陰道片中克霉唑含量的測定方法。方法采用高效液相色譜法，以HYPERSIL ODS C18柱（Φ4.6 mm×250.0 mm），粒度5 μm為分析柱，磷酸氫二鉀溶液（取磷酸氫二鉀4.35 g，加水溶解并稀釋至1 000 ml）-甲醇（1:3）為流動相，流速為1.0 ml/min，檢測波長為254 nm。結(jié)果克霉唑在0.1～5.0 μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。r=0.9999，平均回收率為99.0%。結(jié)論本測定方法簡便，準確，可有效測定克霉唑陰道片中克霉唑的含量。

克霉唑；陰道片；含量測定；反相高效液相色譜法

克霉唑（Clotrimazole）作為廣譜抗真菌藥物之一，其對多種真菌有抑菌作用，特別是白色念珠菌抑制效果最佳?？嗣惯蛩幚碜饔弥饕ㄟ^抑制真菌細胞膜的合成，從而抑制真菌的代謝過程，濃度較高的克霉唑亦有直接殺菌作用。克霉唑陰道片由德國拜耳（Bayer）藥廠開發(fā)并于20世紀90年代末在中國上市[1]?？嗣惯蛟谂R床上主要用于真菌引起的外陰陰道炎、體癬、股癬等病癥?？嗣惯蛳嚓P(guān)產(chǎn)品質(zhì)量控制中主要通過非水滴定法進行含量測定[2-3]，本文對克霉唑陰道片采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）進行克霉唑含量測定，獲得了滿意的結(jié)果。

1　儀器與試藥

高效液相色譜儀為日本島津LC-10AT型，紫外檢測器為日本島津SPD-10A型，反相柱為大連依利特HYPERSIL ODS C18柱。對照品克霉唑購自中國藥品生物制品檢定所，批號：0129-2002，HPLC≥99.5%。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Φ4.6 mm×250.0 mm，粒度5 μm為分析柱，柱溫采用室溫；流動相：磷酸氫二鉀溶液（取磷酸氫二鉀4.35 g，加水溶解并稀釋至1 000 ml）-甲醇（1:3）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm；丙酸睪酮與克霉唑之間的保留時間之比約為1.8，重復性試驗RSD不得高于2.0%。

2.2溶液配制內(nèi)標溶液制備：取丙酸睪酮對照品適量（約33 mg），置200 ml量瓶中，加流動相150 ml超聲溶解約15 min，用流動相稀釋至刻度，搖勻。供試品溶液制備：取本品10片，研細，混勻，精密稱取適量（約相當于克霉唑100 mg），置100 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標溶液20 ml，加入流動相約70 ml，超聲溶解約15 min，用流動相稀釋至刻度，搖勻、過濾，即得。對照品溶液制備：取克霉唑?qū)φ掌愤m量（約50 mg），精密稱定，置于25 ml量瓶中，加流動相約15 ml。

2.3系統(tǒng)適應性試驗取對照品溶液 20 μl，注入液相色譜中，記錄色譜圖，克霉唑tR約為12.3 min，丙酸睪酮tR約為20.0 min，克霉唑峰的理論塔板數(shù)為139 556，丙酸睪酮的理論塔板數(shù)為79 647（圖1）。丙酸睪酮與克霉唑之間的保留時間之比為1.7。

圖1　對照品溶液HPLC圖

2.4陰性干擾試驗依據(jù)克霉唑陰道片處方比例，取乳糖等，按“2.2”溶液配制方法，配制空白溶液，注入液相色譜中，獲取陰性HPLC圖譜。由HPLC圖譜可知處方輔料不干擾克霉唑、丙酸睪酮的含量測定。結(jié)果見圖2、3。

圖2　空白輔料溶液HPLC圖

圖3　克霉唑陰道片樣品溶液HPLC圖

2.5線性關(guān)系考察克霉唑?qū)φ掌啡芤褐瞥?2.05 mg/ml的溶液，精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分別置于10 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標溶液2 ml，用流動相稀釋至刻度，搖勻。按本文色譜條件各進樣20 μl測定，按外標法以對照品克霉唑面積（A）為縱坐標，對照品濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為：A=2.642C－8.321，r=0.9999（n=5）。結(jié)果表明，克霉唑進樣量在0.1～5.0 μg/ml內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6穩(wěn)定性試驗取同一批次克霉唑陰道片供試品溶液，按2.1項色譜條件于0、2、4、6、8 h分別進樣20 μl測定，結(jié)果峰面積的RSD為0.63%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復性試驗分別平行配制同一批制劑室自制克霉唑陰道片（批號：120508）的供試品溶液 5份，按2.1項色譜條件下進樣測定，克霉唑陰道片含量的RSD為0.76%，結(jié)果表明，該測定方法重復性良好。

2.8回收率試驗精密稱取對照品克霉唑（含量99.5%）80 mg、100 mg、120 mg，各平行3份（共9份），置100 ml量瓶中，按克霉唑陰道片處方比例加入混合均勻的輔料，同時精密加入內(nèi)標溶液20 ml，加入流動相約70 ml，超聲溶解約15 min，用流動相稀釋至刻度，搖勻。按照2.5項下操作進行測定。按內(nèi)標法以峰面積計算供試品中 C22H17ClN2的含量，計算回收率。結(jié)果表明，克霉唑陰道片含量測定方法回收率好，準確度較高，見表1。

表1　克霉唑回收率試驗結(jié)果

2.9含量限度本品處方為每片含克霉唑為500 mg，參照USP 24版“Clotrimazole Vaginal Tablets（克霉唑陰道片）”的質(zhì)量標準，將本品定為含克霉唑以（C16H19N3O5S）計應為標示量的93.0%～107.0%。

2.10含量測定取4個批次的克霉唑栓各10片，精密稱定，置蒸發(fā)皿中，水浴上加熱至熔化，冷卻，不停攪拌使混合均勻，精密稱取適量（約相當于克霉唑50 mg），置100 ml量瓶中，加甲醇適量，置50 ℃水浴中振搖使克霉唑溶解，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，置冰浴中放置2 h，立即濾過，取續(xù)濾液放至室溫，作為供試品溶液，按本文色譜條件進樣，見表2。

表2　克霉唑陰道片含量測定(以標示量計)結(jié)果(%)

3　討論

通過對克霉唑陰道片的含量測定來進行質(zhì)量控制，以流動相為空白，用克霉唑陰道片樣品溶液和對照品溶液在240～300 nm掃描，結(jié)果克霉唑在254 nm波長處有最大吸收，因此選擇254 nm為測定波長，與文獻[4-5]報道一致。本文對采用不同組成和比例的流動相進行了比較，如甲醇-磷酸氫二鉀溶液（pH 7.4，比例為3:1）、甲醇-0.1%磷酸（用三乙胺調(diào)pH 6.5，比例35:65）、如甲醇-磷酸氫二鉀溶液（pH 7.4，比例為 2:1），結(jié)果表明，以甲醇-磷酸氫二鉀溶液（pH 7.4，比例為3:1）為流動相顯示效果最好。測量方法采用內(nèi)標法，樣品溶液中加入內(nèi)標物丙酸睪酮，丙酸睪酮與克霉唑之間的保留時間之比為1.8，重復性試驗RSD低于2.0%。采用丙酸睪酮作為內(nèi)標物的測定結(jié)果表明，該方法可排除其他成分和溶液本身顏色的干擾，且操作簡便、準確，可有效地控制克霉唑陰道片制劑的質(zhì)量。

[1] 李青翠,田方,任瑞莉,等.HPLC法測定克霉唑栓的含量[J].藥物分析雜志,2009,29(8):1364-1366.

[2] 中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典(二部)[S].國家藥典委員會,北京2000:276-277.

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[4] 何丹,楊林.RP-HPLC法測定克霉唑乳膏的含量和有關(guān)物質(zhì)[J].中國抗生素雜志,2011,36(4):285-287.

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Determination of Clotrimazole in Clotrimazole Virgin Tablets by RP-HPLC

Li RonghuaLi Ruiming

ObjectiveTo establish a method for determination of clotrimazole clotrimazole vaginal tablets content. MethodsUsing high performance liquid chromatography with ODS-C18column,HYPERSIL(phi 4.6 mm×250.0 mm), particle size of 5 mu m as analytical column,the solution of potassium hydrogen phosphate two(take two 4.35 G potassium hydrogen phosphate,dissolved in water and diluted to 1 000 ml)-methanol(1∶3)as mobile phase,the flow rate is 1 ml/min, the detection wavelength was 254 nm.ResultsClotrimazole in 0.1～5.0 μg/ml range has a good linear relationship. r=0.9999,the average recovery was 99.0%.ConclusionThis method was simple,accurate the content can effectively determine the Clotrimazole Vaginal Tablets in clotrimazole.

Clotrimazole;Virgin tablets;Quality determination;RP-HPLC

R927.2

A

1673-5846(2015)02-0012-03

1佛山市禪城區(qū)瀾石醫(yī)院，廣東佛山528041

2中山大學附屬第一醫(yī)院藥學部，廣東廣州510080

李榮華（1979.9-），本科學歷，主管藥師，藥劑科主任。主要從事醫(yī)院藥學工作。E-mail：lironghua2003@163.com

李瑞明（1974-），本科學歷，主管藥師。研究方向：醫(yī)院制劑。E-mail：liruiming321@163.com