利用無標(biāo)記分子信標(biāo)及核酸染料TOTO-3檢測轉(zhuǎn)基因食品

向東山

（生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000）

利用無標(biāo)記分子信標(biāo)及核酸染料TOTO-3檢測轉(zhuǎn)基因食品

向東山

（生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000）

利用無標(biāo)記的分子信標(biāo)，結(jié)合核酸染料TOTO-3，采用同步熒光分析法，建立一種高靈敏、高選擇性的花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子核酸片段（目標(biāo)DNA）的定量檢測方法。在優(yōu)化條件下，目標(biāo)DNA濃度為2×10—10～200×10—10mol/L之間時(shí)，TOTO-3的熒光強(qiáng)度（?I）與目標(biāo)DNA濃度（C）之間具有良好的線性關(guān)系，其擬合的回歸方程為Δ I = 2.022 2 C+18.411 1。方法檢出限（3σ）為1×10—10mol/L。該方法重復(fù)性好、靈敏度高、選擇性好、檢出限低。利用該方法，結(jié)合不對(duì)稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的檢測。

無標(biāo)記分子信標(biāo)；TOTO-3；熒光；轉(zhuǎn)基因食品；檢測

隨著生物科技的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)各領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的使用，可顯著增加農(nóng)作物的產(chǎn)量，提高農(nóng)作物抗病、抗蟲、抗凍等抗逆能力，改進(jìn)農(nóng)作物的營養(yǎng)品質(zhì)等[1-5]。將各類轉(zhuǎn)基因作物經(jīng)過加工而得到的食品被稱為轉(zhuǎn)基因食品。

轉(zhuǎn)基因食品是一把雙刃劍，在帶給人類巨大實(shí)惠的同時(shí)也帶來了潛在的安全隱患，由于人們對(duì)基因工程掌握的不確定性及不可預(yù)測性，使得轉(zhuǎn)基因食品在安全性、倫理學(xué)以及環(huán)境污染等方面存在潛在的威脅[6-9]，這是人們不得不面對(duì)的一個(gè)重要問題。因此對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的檢測具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，轉(zhuǎn)基因食品的檢測方法主要有兩類：一類是對(duì)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物即產(chǎn)生的特異蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，另一類是直接對(duì)引入的外源基因序列進(jìn)行檢測[10-12]。前一類檢測方法特異性高、操作簡單、成本低、穩(wěn)定性好，但在食品中被檢測蛋白濃度較低時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性。此外，食品的加工程度對(duì)這類檢測方法影響較大，若食品在加工過程中使目標(biāo)蛋白變性也會(huì)性導(dǎo)致假陰性的產(chǎn)生。相對(duì)于第一種檢測方法而言，后一類檢測方法絕大數(shù)結(jié)合了不對(duì)稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，其檢測的靈敏度大大提高，且這類檢測方法較少受食品加工程度的影響。因此，直接對(duì)引入的外源基因序列進(jìn)行檢測的方法在轉(zhuǎn)基因食品的檢測中具有廣泛的應(yīng)用前景。

據(jù)報(bào)道，絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)基因植物使用花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子[13-14]，因此，可以通過檢測樣品中是否含有CaMV 35S啟動(dòng)子來判斷樣品是否為轉(zhuǎn)基因植物。

分子信標(biāo)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)雙標(biāo)記的寡核苷酸探針，具有合成容易、操作簡單、選擇性好以及不必與未反應(yīng)的探針分離即可實(shí)時(shí)檢測等特點(diǎn)，在特定序列單鏈核酸的檢測中扮演著越來越重要的角色[15-18]。近年來，有關(guān)應(yīng)用分子信標(biāo)對(duì)特定序列單鏈核酸檢測的報(bào)道越來越多[19-22]。因此分子信標(biāo)在核酸的定性及定量分析中具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

TOTO-3（quinolinium, 1,1′- [1,3-propanediylbis [(dimethyliminio)-3,1-propanedi-yl]]bis[4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzothiazolylidene)-1-propen-1-yl]]-, iodide）是一種不對(duì)稱的菁酸類染料，它與雙鏈核酸具有高度的親和性。TOTO-3在水溶液中熒光很弱，與單鏈DNA也幾乎不發(fā)生作用，但它與雙鏈核酸結(jié)合后其熒光強(qiáng)度會(huì)增加1 000 倍以上[23]。

本實(shí)驗(yàn)利用無標(biāo)記的分子信標(biāo)（無有機(jī)熒光基團(tuán)和熒滅基團(tuán)）及核酸染料TOTO-3，采用同步熒光分析法，建立了一種高靈敏、高選擇性的CaMV 35S啟動(dòng)子基因序列檢測方法，并結(jié)合不對(duì)稱PCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因食品的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用的大豆油為具有轉(zhuǎn)基因標(biāo)示的金龍魚轉(zhuǎn)基因大豆油，購于湖北省恩施市市場。

TOTO-3 美國Molecular Probes公司；其他所有化學(xué)試劑均為分析純，購于美國Sigma化學(xué)有限公司和國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有的核酸均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（中國）合成并用高效液相色譜法進(jìn)行純化，其核苷酸序列如下：

上游引物：5’-CGA CAG TGG TCC CAA AGA -3’；下游引物：5’-AAG ACG TGG TTG GAA CGT CTT C-3’；無標(biāo)記分子信標(biāo)：5’-GCG CGC TGG ACC CCC ACC CAC GAG GAG CAT CGC GCG C-3’；CaMV 35S啟動(dòng)子寡核苷酸片段序列（目標(biāo)DNA，T）：5’-GAT GCT CCT CGT GGG TGG GGG TCC A-3’。

目標(biāo)核酸的錯(cuò)配序列：一個(gè)堿基錯(cuò)配序列（MT1）：5’-GAT GCT CCT CGT AGG TGG GGG TCC A -3’；兩個(gè)堿基錯(cuò)配序列（MT2）：5’-GAT GCT CAT CGT GGG TAG GGG TCC A-3’；3個(gè)堿基錯(cuò)配序列（MT3）：5’-GAT GCG CCT CGC GGG TGA GGG TCC A-3’。

1.2 儀器與設(shè)備

RF-5301PC型熒光光譜儀 日本Shimadzu公司；PB-21型pH計(jì) 德國Sartorius公司；System 2700 PCR儀美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 檢測原理

核酸染料TOTO-3在水溶液中的熒光很弱，與單鏈DNA的作用也很微弱，但它與雙鏈DNA具有很強(qiáng)的親和性，且與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光信號(hào)會(huì)顯著增強(qiáng)。在沒有目標(biāo)DNA時(shí)，分子信標(biāo)處于莖-環(huán)結(jié)構(gòu)狀態(tài)，分子信標(biāo)的莖較短（只有6 個(gè)堿基對(duì)），與TOTO-3作用后，熒光信號(hào)較弱；在有目標(biāo)DNA時(shí)，目標(biāo)DNA與分子信標(biāo)發(fā)生雜交反應(yīng)，形成較長的雙鏈，與TOTO-3作用后熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。根據(jù)分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA雜交后所形成的雙鏈DNA與TOTO-3結(jié)合后，熒光信號(hào)增加的程度，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定單鏈DNA的檢測。

1.3.2 樣品制備

雜交反應(yīng)由分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA 在一定條件下完成。首先，將目標(biāo)DNA溶解在緩沖溶液中，配制成濃度為1×10—6mol/L的儲(chǔ)備液。取一定量的目標(biāo)DNA溶液加入到適當(dāng)濃度的分子信標(biāo)溶液中并混合均勻，加入緩沖溶液至總體積達(dá)到450 μL，在一定的溫度條件下孵育一定的時(shí)間。在本實(shí)驗(yàn)中，孵育的目的是為了破壞分子信標(biāo)中堿基互補(bǔ)部分的雙鏈，從而加速分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA的反應(yīng)速度。然后，將孵育后的溶液冷卻至室溫，在冷卻的過程中使分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)，待雜交完成后，加入一定濃度的核酸染料TOTO-3 50 μL，使雜交后的雙鏈DNA與核酸染料TOTO-3結(jié)合。在條件優(yōu)化的反應(yīng)中，目標(biāo)DNA及分子信標(biāo)的濃度均為2×10—8mol/L，孵育溫度為60 ℃，孵育時(shí)間為6 min，TOTO-3的濃度為1×10—7mol/L，雙鏈NDA與核酸染料TOTO-3結(jié)合的時(shí)間為20 min。

1.3.3 目標(biāo)DNA的檢測

目標(biāo)DNA的檢測通過對(duì)TOTO-3熒光強(qiáng)度的測定而實(shí)現(xiàn)，TOTO-3的熒光強(qiáng)度通過同步熒光掃描獲得。TOTO-3最大發(fā)射波長與最大激發(fā)波長的波長間隔20 nm，因此本實(shí)驗(yàn)中同步掃描的波長間隔（Δλ）設(shè)置為20 nm。熒光分光光度計(jì)的激發(fā)及發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為10 nm。

1.3.4 堿基錯(cuò)配分析

50 μL濃度為2×10—7mol/L的目標(biāo)DNA序列和相同濃度的堿基錯(cuò)配序列均按照上述樣品制備過程進(jìn)行準(zhǔn)備，然后分別檢測相應(yīng)的熒光信號(hào)，最后進(jìn)行比較和分析。

1.3.5 實(shí)際樣品檢測

針對(duì)真實(shí)樣品的分析，先通過不對(duì)稱PCR獲得含目標(biāo)DNA的單鏈核酸，然后利用無標(biāo)記的分子信標(biāo)及核酸染料TOTO-3對(duì)其進(jìn)行檢測。不對(duì)稱PCR擴(kuò)增可得到大量含目標(biāo)DNA的單鏈核酸，分子信標(biāo)在與其反應(yīng)時(shí)不需要相互競爭，可顯著地提高檢測的靈敏度。不對(duì)稱PCR擴(kuò)增的條件為：PCR反應(yīng)液總體積為50 μL（上游引物與下游引物的比例為40∶1，引物序列見1.1節(jié)）。4 μL模板（來自于轉(zhuǎn)基因大豆油），5 mmol/L的 MgCl2溶液8 μL，PCR 緩沖液5 μL，2.5 mmol/L 的dNTPs 4 μL，20 μmol/L的上游引物2 μL，1 μmol/L的下游引物1 μL，5 U Taq聚合酶，加蒸餾水至總體積為50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min后，按94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸50 s進(jìn)行PCR循環(huán)反應(yīng)，35 次循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后用緩沖溶液將反應(yīng)體系進(jìn)行稀釋，然后加入50 μL 2×10—7mol/L的分子信標(biāo)，用蒸餾水稀釋至450 μL，在60 ℃孵育6 min。冷卻至室溫，再將50 μL 1×10—6mol/L TOTO-3溶液加入至上述溶液中搖勻，室溫放置20 min后，用同步分析法對(duì)其熒光進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同緩沖溶液對(duì)測定結(jié)果的影響

不同緩沖的溶液所含的陰、陽離子各不相同，離子強(qiáng)度也各不一樣，它們對(duì)DNA的雜交及熒光染料都有影響。實(shí)驗(yàn)測試了伯瑞坦-羅賓森緩沖溶液（brittonrobinson buffer，BR）、磷酸緩沖溶液（phosphate buffer，PB）、三（羥甲基）氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液（Tris (hydroxymethyl) aminomethane-HCl buffer，Tris）及硼酸-硼砂緩沖溶液（boric acid-borax buffer，B）對(duì)測定結(jié)果的影響，結(jié)果（圖1）表明，緩沖溶液對(duì)測定結(jié)果影響不大，Tris緩沖溶液效果略好，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇Tris緩沖溶液。

圖 1 不同緩沖溶液對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of buffer solutions on the fl uorescence intensity

2.2 pH值對(duì)測定結(jié)果的影響

緩沖溶液的pH值可以影響單鏈DNA的雜交反應(yīng)，另外核酸染料TOTO-3的熒光強(qiáng)度隨也pH值的變化而變化。實(shí)驗(yàn)測試了6 個(gè)不同pH值的Tris緩沖溶液對(duì)測定結(jié)果的影響。結(jié)果（圖2）表明，在pH 7.0～8.2的范圍內(nèi)，核酸染料TOTO-3的熒光強(qiáng)度隨pH值的增加而增加，當(dāng)pH值大于8.2時(shí)，熒光強(qiáng)度逐漸下降。因此選擇緩沖溶液的pH值為8.2。

圖 2 pH值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of pH on the fl uorescence intensity

2.3 孵育溫度對(duì)測定結(jié)果的影響

常溫時(shí)，分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA之間的雜交反應(yīng)較慢，為了加快反應(yīng)速度，通過加熱的方式打開分子信標(biāo)末端互補(bǔ)的堿基對(duì)。為了找到合適的孵育溫度，實(shí)驗(yàn)考察不同孵育溫度對(duì)測定結(jié)果的影響。結(jié)果（圖3）表明，孵育溫度在30～60 ℃之間時(shí)，核酸染料TOTO-3的熒光強(qiáng)度隨著溫度的升高而增加，當(dāng)孵育溫度在大于60 ℃時(shí)，其熒光強(qiáng)度基本不再發(fā)生變化。因此最佳孵育溫度為60 ℃。

圖 3 孵育溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of incubation temperature on the fl uorescence intensity

2.4 孵育時(shí)間對(duì)測定結(jié)果的影響

圖 4 孵育時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of incubation time on the fl uorescence intensity

本實(shí)驗(yàn)中，孵育的主要目的是為了將分子信標(biāo)的莖打開，因此孵育時(shí)間是影響分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA雜交反應(yīng)速率的重要因素。實(shí)驗(yàn)對(duì)不同的孵育時(shí)間進(jìn)行測試。結(jié)果（圖4）表明，反應(yīng)時(shí)間在2～6 min內(nèi)，核酸染料TOTO-3的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的延長而增加，當(dāng)孵育時(shí)間超過6 min時(shí)，熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，說明在6 min內(nèi)即可將分子信標(biāo)的莖完全打開。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇的孵育時(shí)間為6 min。

2.5 離子強(qiáng)度對(duì)測定結(jié)果的影響

離子具有穩(wěn)定雙鏈DNA的作用。實(shí)驗(yàn)通過加入不同濃度的NaCl考察離子強(qiáng)度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了6 個(gè)不同NaCl濃度，并測試了它們對(duì)測定結(jié)果的影響。結(jié)果（圖5）表明，NaCl的濃度在0～80 mmol/L之間時(shí)，TOTO-3的熒光強(qiáng)度隨著NaCl濃度的增加而增加。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到80 mmol/L后，其熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)選擇NaCl濃度為80 mmol/L。

圖 5 離子強(qiáng)度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of ionic strength on the fl uorescence intensity

2.6 雙鏈DNA與TOTO-3結(jié)合時(shí)間對(duì)測定結(jié)果的影響

核酸染料TOTO-3只有與雙鏈DNA結(jié)合之后才會(huì)發(fā)出較強(qiáng)的熒光，因此它與雙鏈DNA的結(jié)合時(shí)間是影響其熒光強(qiáng)度的一個(gè)重要因素。實(shí)驗(yàn)對(duì)TOTO-3與雙鏈DNA的作用時(shí)間進(jìn)行了考察。結(jié)果（圖6）表明，TOTO-3與雙鏈DNA的作用在20 min內(nèi)即可完成，當(dāng)結(jié)合時(shí)間超過20 min后，其熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。因此本實(shí)驗(yàn)選擇TOTO-3與雙鏈DNA的最佳結(jié)合時(shí)間為20 min。

圖 6 雙鏈DNA與TOTO-3結(jié)合時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of binding time between ds-DNA and TOTO-3 on the fl uorescence intensity

2.7 工作曲線及檢出限

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)目標(biāo)DNA的濃度與相應(yīng)TOTO-3熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系進(jìn)行測試，并找出目標(biāo)DNA濃度與染料TOTO-3熒光強(qiáng)度之間的線性范圍。結(jié)果（圖7）表明，在目標(biāo)DNA濃度為2×10—10～200×10—10mol/L之間時(shí)，TOTO-3的熒光強(qiáng)度（?I）與目標(biāo)DNA濃度（C）之間具有良好的線性關(guān)系。其擬合的回歸方程為?I=2.022 2 C+18.411 1（R2= 0.995 9）。對(duì)7個(gè)濃度為2×10—9mol/L的平行樣品分別進(jìn)行檢測以評(píng)價(jià)方法的精密度，7個(gè)檢測結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為3.33%，說明方法具有較好的精密度。用空白試劑標(biāo)準(zhǔn)偏差（n = 11）的3 倍除以回歸方程的斜率得方法檢出限為1×10—10mol/L。

圖 7 TOTO-3的熒光強(qiáng)度與目標(biāo)DNA濃度之間的線性關(guān)系Fig. Linear relationship between the fl uorescence intensity of TOTO-3 and the concentration of target DNA

2.8 堿基錯(cuò)配實(shí)驗(yàn)

按照堿基錯(cuò)配的實(shí)驗(yàn)方法，通過對(duì)不同堿基錯(cuò)配序列的分析，測試了方法的特異性。圖8表明，在目標(biāo)DNA與錯(cuò)配DNA濃度相同的情況下，目標(biāo)DNA所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度（已扣除熒光背景）遠(yuǎn)大于一個(gè)堿基錯(cuò)配的DNA序列，這表明該方法具有很高的選擇性。

圖 8 方法特異性測試Fig.8 Specifi city of the method

2.9 實(shí)際樣品的分析

利用上述分析方法，結(jié)合不對(duì)稱PCR技術(shù)對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行分析。根據(jù)實(shí)際樣品分析步驟，實(shí)驗(yàn)比較了有模板DNA和沒有模板DNA存在的分析結(jié)果。結(jié)果表明，單獨(dú)的TOTO-3溶液熒光信號(hào)很弱（圖9a），沒有模板DNA時(shí)，核酸染料TOTO-3 的熒光信號(hào)也較弱（圖9b），這表明在擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有含目標(biāo)DNA的核酸片段。當(dāng)有模板DNA時(shí)，核酸染料TOTO-3 的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)（圖9c），這表明在擴(kuò)增產(chǎn)物中有較多的含目標(biāo)DNA的核酸片段。這充分說明，該方法能用于轉(zhuǎn)基因食品的分析。

圖 9 沒有模板DNA存在（a、b）和有模板DNA存在（c）的不對(duì)稱PPCCRR比較Fig.9 Comparison of asymmetric PCR without (a, b) and with (c) template DNA

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用無標(biāo)記的分子信標(biāo)及核酸染料TOTO-3，建立了一種特定序列核酸檢測的新方法。利用該方法，并結(jié)合不稱PCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的檢測。該方法操作簡單、檢測速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、檢出限低。

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Detection of Genetically Modifi ed Food with a Non-Labeled Molecular Beacon and a Nucleic Acid Dye TOTO-3

XIANG Dongshan
(Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province, School of Chemical and Environmental Engineering, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China)

A highly sensitive and selective detection method for DNA of caulifl ower mosaic virus (CaMV) 35S promoter (target DNA) was developed using a non-labeled molecular beacon (MB) and a nucleic acid dye TOTO-3. Under the optimum conditions, the fl uorescence intensity of TOTO-3 exhibited good linear dependence on the quantity of the target DNA in the range of 2×10-10–200×10-10mol/L. The fi tted regression equation was ? I = 2.022 2 C + 18.411 1, and the limit of detection was 1 ×10-10mol/L (3σ). The proposed method had a good precision, low detection limit, good selection and high sensitivity. The detection of genetically modifi ed food could be achieved by this proposed method based on asymmetric polymerase chain reaction (PCR).

S132

A

1002-6630（2015）02-0174-05

10.7506/spkx1002-6630-201502033

2014-04-08

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（21465010）；湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（D20131905；D20131906）；

生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（PKLHB1316）；湖北民族學(xué)院團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（MY2013T003）；

湖北省林學(xué)一級(jí)學(xué)科資助項(xiàng)目

向東山（1974—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。E-mail：zk3100@sohu.com

Kay words: non-labeled molecular beacons; TOTO-3; fl uorescence; genetically modifi ed food; detection