大葉麻竹筍多糖分離純化工藝

吳金松，鄭 炯，夏雪娟，汪 健，闞建全,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.鄭州科技學院食品科學與工程學院，河南 鄭州 450064；3.重慶市食品藥品監(jiān)督檢驗所，重慶 401121）

大葉麻竹筍多糖分離純化工藝

吳金松1,2，鄭 炯1，夏雪娟1，汪 健3，闞建全1,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.鄭州科技學院食品科學與工程學院，河南 鄭州 450064；3.重慶市食品藥品監(jiān)督檢驗所，重慶 401121）

以水提醇沉法提取到的大葉麻竹筍粗多糖為原料，對其進行脫蛋白、透析脫色、DEAE-52纖維素柱層析分級、Sephadex-50葡聚糖凝膠柱分級處理，探究大葉麻竹筍多糖的分離純化工藝。研究結果表明，木瓜蛋白酶結合Sevag法是最佳脫蛋白條件；進行DEAE-52纖維素柱分級，以純水、0.05mol/L和0.1mol/L NaCl溶液洗脫獲得了3 種主要的大葉麻竹筍多糖組分BSP1、BSP2、BSP3；再進行Sephadex-50葡聚糖凝膠分級，分別純化得到了BSP1A、BSP2A、BSP3B 3種多糖組分，這3 種多糖組分基本不含蛋白質(zhì)和核酸，且純度均達到了95.3%以上。

大葉麻竹筍多糖；脫蛋白法；透析脫色法；分級純化法；純度鑒定

竹筍是禾本科（Poaceae）竹亞科（Bambusoideae）植物的新生芽，一直以來以高纖維、低脂、營養(yǎng)豐富的“素食第一品”著稱[1]；大葉麻竹（Dendrocalamus latiflorus）是中國產(chǎn)筍量較高的品種之一，具有較高的營養(yǎng)價值[2-3]。多糖是大葉麻竹筍中一種重要生物活性成分，傳統(tǒng)水提醇沉法從大葉麻竹筍中提取得到的多糖不僅產(chǎn)率較低，而且粗多糖中含有蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，純度較低[4]。因此，探究大葉麻竹筍多糖的最佳分離純化工藝對于更深層次的結構分析和活性研究有著重要的意義。

活性多糖分離純化工藝一般包括多糖除雜和多糖分級兩個過程。其中多糖的除雜過程包括粗多糖的脫去蛋白、脫去色素和流水透析除去小分子化合物等[5-9]；多糖的分級過程主要包括乙醇沉淀分級、季銨鹽沉淀分級、金屬鹽沉淀法分級和DEAE-纖維素凝膠色譜分離[10-14]。通常一次分級純化很難達到理想的分級效果。因此，本研究采取DEAE-52纖維素陰離子交換柱初次純化和葡聚糖凝膠柱色譜再次純化相結合的方法。由于竹亞科植物中含有的多糖一般為相對分子質(zhì)量不大的水溶性多糖[15]，本實驗采取DEAE-52纖維素和Sephadex-50葡聚糖凝膠作為柱色譜分級的填充料，以期獲得較高純度的大葉麻竹筍多糖。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大葉麻竹筍 北碚農(nóng)貿(mào)市場。

無水乙醇、氯化鈉、葡萄糖標品、苯酚、硫酸、無水乙醚、丙酮、葡萄糖、氯仿、三氯乙酸、正丁醇、亞磷酸、考馬斯亮藍G250（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 上海如吉生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力50 000 U/g） 南寧東恒華道生物科技有限責任公司；MWCO.1000即用型透析袋（1 000 D） 美國Spectrum公司；DEAE-52纖維素 北京索萊寶科技有限公司；Sephadex-50、Sephadex-100葡聚糖凝膠 瑞典Pharmacia公司。

1.2 儀器與設備

玻璃層析柱（2.8 cm×50 cm和1.6 cm× 70 cm） 成都東方玻璃儀器公司；722可見光分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；SHZⅢ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器有限公司；78-1磁力加熱攪拌器 常州奧華儀器有限公司；BS-100A自動部分收集器、HL-2D恒流泵 上海青浦滬西儀器廠；UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 大葉麻竹筍多糖分離純化工藝流程

大葉麻竹筍粗多糖→脫蛋白→流水透析→乙醇沉淀→冷凍干燥→DEAE-52纖維素柱色譜分級→收集洗脫液→苯酚-硫酸法跟蹤檢測→490nm波長條件下作洗脫曲線→收集洗脫峰組分→Sephadex-50葡聚糖凝膠柱色譜分級→同上收集洗脫峰組分→真空濃縮→冷凍干燥→精制大葉麻竹筍多糖

1.3.2 大葉麻竹筍多糖脫蛋白工藝[16-17]

1.3.2.1 Sevag法

Sevag試劑用氯仿和正丁醇體積比4∶1配制，再按Sevag試劑與多糖溶液體積比2∶5加入Sevag試劑，混合物劇烈振搖30 min，靜置2 h后，棄去底層白色蛋白乳濁液，重復操作8 次以上，直到兩相界面無變性蛋白為止，取少許多糖溶液，稀釋至適當?shù)馁|(zhì)量濃度，苯酚-硫酸法[18]和考馬斯亮藍法[19]測定多糖及蛋白含量。

1.3.2.2 正丁醇-三氯乙酸法

選取樣品液與三氯乙酸-正丁醇體積比1∶2、三氯乙酸與正丁醇體積比1∶5、振搖時間30 min、靜置時間3 h，進行沉淀后，離心除去膠狀沉淀。重復以上的操作直至溶液不再繼續(xù)混濁為止，取少許多糖溶液，稀釋至適當?shù)馁|(zhì)量濃度，苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍法測定多糖及蛋白含量。

1.3.2.3 三氯乙酸法

三氯乙酸是一種有機酸，使多糖提取液中的蛋白質(zhì)與有機酸作用而變性沉淀。該法是在多糖水提液中滴加一定質(zhì)量分數(shù)與多糖水提取液等體積的三氯乙酸，混勻靜置過夜，離心除去膠狀沉淀，取少許多糖溶液，稀釋至適當?shù)馁|(zhì)量濃度，苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍法測定多糖及蛋白含量。

1.3.2.4 酶解結合Sevag法

加0.5 mg/mL的木瓜蛋白酶，60 ℃恒溫水浴條件下保持3 h，然后升溫至90 ℃、10 min進行滅酶處理，后面處理方法如Sevag法所述。

1.3.3 大葉麻竹筍多糖透析脫色[20]

取脫蛋白后的水相溶液流水透析48 h，透析液濃縮至適當體積，加入3 倍無水乙醇進行沉淀，4 ℃靜置4 h，4 500 r/min離心15 min后取沉淀，無水乙醇反復洗滌沉淀，經(jīng)過冷凍干燥，即為粗品竹筍多糖。

1.3.4 纖維素柱色譜分級[21]

DEAE-52纖維素進行活化處理后，采用濕法裝柱。取脫蛋白、透析后的粗多糖樣品100 mg用純水溶解后上柱，按照順序用蒸餾水及0.05、0.1、0.2、0.5 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，每個梯度洗脫300 mL，先經(jīng)過純水洗脫平衡除雜，自動部分收集器收集洗脫液，4 mL/管，以硫酸苯酚法[22]進行跟蹤檢測，測定每管洗脫液490 nm波長處吸光度，以管數(shù)為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線圖。

1.3.5 葡聚糖凝膠柱色譜分級[23]

1.3.5.1 Sephadex-50葡聚糖凝膠的預處理

取一定量的Sephadex-50葡聚糖凝膠加三蒸水加熱煮沸3h膨化，待凝膠膨化完成后，用水反復漂洗，傾瀉去除表面的雜質(zhì)和不均勻的細小凝膠顆粒。

1.3.5.2 Sephadex-50葡聚糖凝膠柱層析

將經(jīng)過預處理的Sephadex-50葡聚糖凝膠采用濕法裝柱，分別取纖維素柱純化過的3種多糖組分BSP1、BSP2、BSP3各30 mg溶解后上Sephadex-50葡聚糖凝膠柱（1.6 cm×70 cm），以蒸餾水做洗脫液，自動部分收集器收集洗脫液，每管約3 mL，以苯酚硫酸法跟蹤檢測每管洗脫液490 nm波長處的吸光度，以管數(shù)為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線圖。

產(chǎn)后產(chǎn)婦因妊娠期和產(chǎn)后內(nèi)分泌紊亂，易出現(xiàn)精神方面癥狀，特別是當新生兒有畸形或性別不如意時，產(chǎn)婦會出現(xiàn)失望、情緒低落、食欲不振、睡眠不好等情況，若不進行及時的心理護理，短期會影響子宮復舊，造成大出血，遠期會遺留產(chǎn)后抑郁癥。服務人員應針對個體情況科學安慰產(chǎn)婦，向其講述不良心理狀態(tài)對自己身體的影響。經(jīng)常了解產(chǎn)婦的身體狀況和新生兒情況，講解新生兒可能出現(xiàn)的一些生理變化，使產(chǎn)婦放心。同時，告訴產(chǎn)婦母乳喂養(yǎng)的好處，使產(chǎn)婦建立母乳喂養(yǎng)的信心并指導產(chǎn)婦采用正確的哺乳方法以及充分休息、保持心情舒暢、營養(yǎng)豐富的飲食，早哺乳有利于乳汁分泌。

1.3.6 大葉麻竹筍多糖純度鑒定

1.3.6.1 凝膠過濾法[24-25]

分別取經(jīng)Sephadex-50葡聚糖凝膠柱分離純化后的不同組分，溶解后上Sephadex-100葡聚糖凝膠柱（1.6 cm×70 cm），以蒸餾水為洗脫液。自動部分收集器收集洗脫液，每管約6 mL，通過苯酚硫酸法跟蹤檢測每管洗脫液A490nm，以490 nm波長處吸光度對洗脫液管數(shù)做洗脫曲線圖。

1.3.6.2 紫外全波段掃描法[26]

經(jīng)過純化后的3 種主要多糖組分，分別命名為BSP1A、BSP2A、BSP3B，分別取一定量的3 種多糖組分溶于純水中，在紫外分光光度計上進行190～400 nm波長處的全波段掃描。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.6和Excel進行圖表的繪制，正交軟件和SPSS 19.0軟件進行相關數(shù)據(jù)的處理。

2 結果與分析

2.1 大葉麻竹筍多糖脫蛋白

2.1.1 Sevag法脫蛋白

圖 1 Sevag法脫蛋白結果Fig.1 Removal of protein by Sevag method

如圖1所示，隨著處理次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)脫除率隨之增加，處理8 次以上，蛋白質(zhì)脫除率可達到80%以上；但是處理次數(shù)的增加會導致多糖保留率降低，經(jīng)過6 次脫蛋白處理后，多糖保留率低于60%，之后趨于平穩(wěn)。由于每次沉淀蛋白質(zhì)變性化合物時，同時不可避免的包含了部分多糖，此外一些糖蛋白等蛋白復合物在處理時也可能會沉淀下來，導致了部分多糖損失。Sevag法作為一種傳統(tǒng)的脫蛋白方法，蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率都較高，適宜竹筍粗多糖的脫蛋白處理，處理8 次以上可以達到良好的效果。

2.1.2 正丁醇-三氯乙酸法脫蛋白

圖 2 正丁醇-三氯乙酸法脫蛋白結果Fig.2 Removal of protein by trichloroacetic acid-butanol method

如圖2所示，經(jīng)過前3 次處理后，粗多糖溶液中蛋白質(zhì)脫除率就大幅提高，之后隨著處理次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)脫除率雖然也隨之增加，但是增加幅度趨緩，經(jīng)過5 次處理后蛋白質(zhì)脫除率達到85.6%。但是，由于每次的脫蛋白處理都會造成溶液中多糖保留率的下降，經(jīng)過5 次處理后多糖保留率僅為率33.76%。相比于Sevag法，正丁醇-三氯乙酸法脫除蛋白質(zhì)效果較佳，但是更易引起多糖的降解。因此，該方法不適宜大葉麻竹筍多糖脫蛋白。

2.1.3 三氯乙酸法脫蛋白

圖 3 三氯乙酸法脫蛋白結果Fig.3 Removal of protein by trichloroacetic acid method

如圖3所示，竹筍粗多糖溶液經(jīng)不同質(zhì)量分數(shù)三氯乙酸脫蛋白處理，三氯乙酸質(zhì)量分數(shù)為12%時，蛋白質(zhì)脫除率最高，達到78.2%，由于三氯乙酸具有酸性，會引起多糖的降解，導致部分多糖損失；隨著三氯乙酸質(zhì)量分數(shù)增加，多糖保留率逐漸降低，減少到50%以下。蛋白質(zhì)脫除率在三氯乙酸質(zhì)量分數(shù)達到12%后增加不顯著，因此，用該方法處理，三氯乙酸質(zhì)量分數(shù)采用12%較好，但是相比于Sevag法，多糖保留率較低，因此該方法不如Sevag法脫蛋白效果好。

2.1.4 木瓜蛋白酶結合Sevag法脫蛋白

圖 4 酶結合Sevag法脫蛋白結果Fig.4 Removal of protein by combined use of papain treatment and Sevag method

如圖4所示，經(jīng)過6 次脫蛋白處理后，蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率趨于穩(wěn)定，比較圖3可知，酶結合法處理6次后可以達到Sevag法處理10 次以上的效果，這是因為木瓜蛋白酶的酶解作用，導致糖結合蛋白分離開來，進而有利于蛋白質(zhì)的脫除，由于木瓜蛋白酶的作用，減少了處理次數(shù)，提高了脫蛋白效率，因此木瓜蛋白酶酶解結合Sevag法是大葉麻竹筍粗多糖脫蛋白最佳工藝。

2.2 大葉麻竹筍多糖DEAE-52纖維素陰離子交換柱色譜分級

圖 5 大葉麻竹筍多糖DEAE-52纖維素層析柱洗脫曲線Fig.5 Elution profi les on DEAE-cellulose 52 chromatographic column

采用DEAE-52纖維素陰離子交換層析柱對大葉麻竹筍多糖進行純化，硫酸-苯酚法顯色，結合特征吸收峰檢測多糖，洗脫曲線見圖5，以純水、0.05 mol/L NaCl溶液、0.1 mol/L NaCl溶液、0.2 mol/L NaCl溶液、0.5 mol/L NaCl溶液為洗脫液，洗脫組分分別命名為BSP1、BSP2、BSP3、BSP4、BSP5。分別收集各吸收峰洗脫液，旋轉蒸發(fā)濃縮，透析后冷凍干燥，計算出得率分別為19.3%、25.4%、29.6%、4.6%、2.2%。由于BSP4、BSP5得率太低，而BSP1、BSP2、BSP3得率較高，所以BSP1、BSP2、BSP3作為主要的洗脫組分。

2.3 大葉麻竹筍多糖組分Sephadex-50葡聚糖凝膠洗脫

2.3.1 大葉麻竹筍多糖組分BSP1 Sephadex-50葡聚糖凝膠洗脫曲線

圖 6 大葉麻竹筍多糖組分BSP1 Sephadex-50葡聚糖凝膠洗脫曲線Fig.6 Elution profi les of BSP1 on Sephadex-50 chromatographic column

如圖6所示，經(jīng)DEAE-52纖維素分級純化后的多糖組分BSP1分別用純水、0.05 mol/L NaCl溶液和0.1 mol/L NaCl溶液經(jīng)過Sephadex-50葡聚糖凝膠洗脫，得到BSP1A、BSP1B、BSP1C 3種多糖組分，其得率分別為40.6%、8.5%、5.3%。由于BSP1B、BSP1C兩種多糖組分得率太低，本研究選擇得率最高的BSP1A做進一步的分析研究。

2.3.2 大葉麻竹筍多糖組分BSP2 Sephadex-50葡聚糖凝膠洗脫曲線

如圖7所示，經(jīng)DEAE-52纖維素分級純化后的多糖組分BSP2過Sephadex-50葡聚糖凝膠，分別用純水、0.05 mol/L NaCl溶液和0.1 mol/L NaCl溶液洗脫，得到BSP2A、BSP2B、BSP2C 3種多糖組分，其得率分別為47.9%、5.5%、9.8%。由于BSP2B、BSP2C兩種多糖組分得率太低，本研究選擇得率最高的BSP2A做進一步分析研究。

圖 7 大葉麻竹筍多糖組分BSP2 Sephadex-50葡聚糖凝膠洗脫曲線Fig.7 Elution profi les of BSP2 on Sephadex-50 chromatographic column

2.3.3 大葉麻竹筍多糖組分BSP3 Sephadex-50葡聚糖凝膠洗脫曲線

圖 8 大葉麻竹筍多糖組分BSP3 Sephadex-50葡聚糖凝膠洗脫曲線Fig.8 Elution profi les of BSP3 on Sephadex-50 chromatographic column

如圖8所示，經(jīng)DEAE-52纖維素分級純化后的多糖組分BSP3過Sephadex-50葡聚糖凝膠，分別用純水、0.05 mol/L NaCl溶液和0.1mol/L NaCl溶液洗脫，得到BSP3A、BSP3B、BSP3C、BSP3D 4種多糖組分，其得率分別為4.7%、53.4%、3.8%、5.9%。由于BSP3A、BSP3C、BSP3D 3種多糖組分得率太低，且BSP3C、BSP3D兩種多糖分離效果不佳，所以本研究選擇得率較高的BSP3B做進一步的分析研究。

2.4 大葉麻竹筍多糖純度鑒定

2.4.1 凝膠過濾洗脫曲線

圖 9 BSP1A Sephadex-100葡聚糖凝膠柱色譜洗脫曲線Fig.9 Elution prolife on Sephadex G-100 column

圖 10 BSP2A Sephadex-100葡聚糖凝膠柱色譜洗脫曲線Fig.10 Elution profi le on Sephadex G-100 column

圖 11 BSP3B Sephadex-100葡聚糖凝膠柱色譜洗脫曲線Fig.11 Elution profi le on Sephadex G-100 column

如圖9～11所示，3種多糖組分以純水為洗脫液，經(jīng)過Sephadex-100葡聚糖凝膠柱色譜分級后，洗脫曲線為單一對稱峰，說明大葉麻竹筍3種多糖組分是較純的物質(zhì)。

2.4.2 大葉麻竹筍多糖組分紫外掃描

圖 12 多糖組分紫外掃描圖譜Fig.12 Ultraviolet spectra of purifi ed polysaccharides

如圖12所示，3 種不同質(zhì)量濃度的多糖組分溶液在波長190～400 nm范圍內(nèi)，經(jīng)過紫外掃描后，BSP1A、BSP2A、BSP3B在260 nm和280 nm波長處均無明顯吸收峰，說明經(jīng)過葡聚糖凝膠色譜分級后，收集到的3種多糖組分較純，基本不含有蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì)。結合凝膠過濾法洗脫曲線，并且通過測定其多糖含量，測得其純度為96.1%、95.3%、95.7%，因此可以判定3 種大葉麻竹筍多糖組分是較純的物質(zhì)。

3 結 論

通過比較不同的脫蛋白工藝，木瓜蛋白酶結合Sevag法是最佳的脫蛋白工藝。由于竹筍多糖溶液顏色不是很深，通過流水透析可以除去大部分色素。DEAE-52纖維素陰離子交換柱初次純化和葡聚糖凝膠柱色譜再次純化后，分離到了BSP1A、BSP2A、BSP3B這3 種多糖組分。凝膠過濾和紫外全波段掃描可以鑒定出3 種多糖組分是較純的物質(zhì)，且純度均達到了95.3%以上。由于通過DEAE-52纖維素陰離子交換柱初次純化后，多糖組分BSP1、BSP2、BSP3純度在85.6%左右，純度較低，需要進一步的葡聚糖凝膠柱純化，再次純化后，純度較高，有利于進一步的活性分析和結構鑒定。

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Separation and Purifi cation of Polysaccharides from Ma Bamboo Shoots (Dendrocalamus latifl orus)

WU Jinsong1,2, ZHENG Jiong1, XIA Xuejuan1, WANG Jian3, KAN Jianquan1,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. College of Food Science and Engineering, ZhengZhou University of Science and Technology, Zhengzhou 450064, China; 3. Chongqing Institute for Food and Drug Control, Chongqing 401121, China)

The aim of this study was to optimize the separation and purifi cation of polysaccharides from Ma bamboo shoots (Dendrocalamus latiflorus). Crude polysaccharides were extracted from bamboo shoots by hot water extraction method, deproteinized, decolorized by dialysis and fractionated by DEAE-52 cellulose and Sephadex-50 column chromatography. The results showed that papain treatment combined with Sevag method was the best deproteinization condition. Three major polysaccharide fractions were eluted from DEAE-52 cellulose with water, 0.05 mol/L NaCl and 0.1 mol/L NaCl, namely BSP1, BSP2 and BSP3, respectively. The fractions were further purifi ed by Sephadex-50 column chromatography to produce BSP1A, BSP2A and BSP3B, respectively. These further purifi ed polysaccharides were found to contain almost no protein or nucleic acid with a purity more than 95.3%.

bamboo shoot polysaccharide; deproteinization; dialysis; fractionation; purity identifi cation

TS255.1

A

1002-6630（2015）02-0080-05

10.7506/spkx1002-6630-201502015

2014-06-22

吳金松（1988—），男，碩士研究生，研究方向為食品化學與營養(yǎng)學。E-mail：wujinsong88@126.com

*通信作者：闞建全（1965—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與營養(yǎng)學、食品質(zhì)量與安全。

E-mail：ganjq1965@163.com