骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝硬化的研究進(jìn)展

易　敏(綜述)，付必莽，張　捷(審校)

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，昆明 650000)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝硬化的研究進(jìn)展

易敏△(綜述)，付必莽，張捷※(審校)

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，昆明 650000)

肝硬化是許多肝病發(fā)生、發(fā)展中必經(jīng)的病理階段，在此階段臨床上并無有效的治療方式，直至疾病進(jìn)一步發(fā)展，最終實行肝移植。在我國肝移植技術(shù)發(fā)展已經(jīng)很成熟，但移植后的一系列問題任然困擾著國內(nèi)外的學(xué)者，在此基礎(chǔ)上干細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)成為肝病治療的一個新方向。如果能在肝硬化的早中期行干細(xì)胞移植改善肝臟功能，提高患者生活質(zhì)量對于大多數(shù)肝病患者來說是最大的福音。間充質(zhì)干細(xì)胞的在我國很多地方都只是處于動物實驗研究的階段，然而正是由于有著如此多的研究數(shù)據(jù)，為更深一步的研究，以至于應(yīng)用于臨床打下了堅實的基礎(chǔ)。現(xiàn)就骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝硬化的研究進(jìn)展予以綜述。

1間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞是除造血干細(xì)胞外被認(rèn)為骨髓中參與肝再生的細(xì)胞，其在體外可分化為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種間充質(zhì)來源的細(xì)胞，從而成為研究熱點。雖然干細(xì)胞研究取得了一定的成果，但其治療的有效性和安全性仍面臨著眾多的質(zhì)疑。

2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基因移植治療肝硬化的機(jī)制和進(jìn)展

肝纖維化指肝組織內(nèi)因細(xì)胞外基質(zhì)合成增加、降解相對不足而在肝內(nèi)異常沉積所致肝臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常改變的一種病理變化，最終發(fā)展為肝硬化。機(jī)體對慢性損傷的主動性修復(fù)反應(yīng)以肝臟的細(xì)胞外基質(zhì)增生與沉積為特征。自體骨髓干細(xì)胞移植技術(shù)治療肝硬化的機(jī)制主要是在肝損害時骨髓干細(xì)胞分化為具有肝臟功能的肝細(xì)胞，補充減少的肝細(xì)胞，通過有效改善肝內(nèi)外微環(huán)境，使肝內(nèi)某種應(yīng)激反應(yīng)和某些炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這是骨髓干細(xì)胞移植治療各種疾病的理論基礎(chǔ)[1]。目前關(guān)于骨髓干細(xì)胞在肝臟疾病中的治療機(jī)制可能與下列因素有關(guān)。

2.1抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)激活HSCs的活化是肝纖維化產(chǎn)生的重要因素。其主要作用是在正常肝組織和肝硬化時合成細(xì)胞外基質(zhì)成分。細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞外大分子構(gòu)成的高度的有組織的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，為組織器官的完整性提供力學(xué)支持和物理強(qiáng)度的物質(zhì)，影響細(xì)胞的存活、死亡、增殖和分化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠抑制HSCs增殖活化。Sakaida[2]研究證實，經(jīng)門靜脈注射骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)可抑制HSCs的活性和炎性分子的表達(dá)，保護(hù)線粒體的功能，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而提高大鼠肝細(xì)胞的再生，減少再生肝的纖維化。Parekkadan等[3]研究發(fā)現(xiàn)，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)后，移植的間充質(zhì)干細(xì)胞通過旁分泌作用分泌多種抗纖維化的細(xì)胞因子和生長因子，誘導(dǎo)HSCs凋亡，減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，抑制肝組織炎癥反應(yīng)和纖維化的形成。

2.2分泌相關(guān)的細(xì)胞因子BMSCs可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，這些旁分泌細(xì)胞因子對修復(fù)損傷起著重要作用[4]，肝損傷時受損的上皮或內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)吸引外周血中的炎性細(xì)胞聚集到受損的肝細(xì)胞中，然后釋放促纖維化相關(guān)的介質(zhì)，如轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)β1、TGF-α和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，引起HSCs的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的形成[5]。最近有報道，促炎性細(xì)胞反應(yīng)因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)17在各種肝臟疾病中發(fā)揮重要作用。IL-17由CD4+細(xì)胞、Th17細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、柱狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生[6-7]，在宿主抵抗外源性病原微生物和誘導(dǎo)組織炎癥中發(fā)揮重要作用[8]。一方面IL-17刺激Kupffer細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子，如重組人TNF-α和TGF-β1，另一方面IL-17直接刺激肝的星型細(xì)胞表達(dá)膠原蛋白并且促使其活化為成纖維細(xì)胞。骨髓干細(xì)胞移植通過下調(diào)IL-17減少肝損傷和纖維化可能與以上有兩個機(jī)制有關(guān)。研究表明，IL-17可在人類和大鼠誘導(dǎo)肝損傷和肝纖維化[9-10]。Zheng等[11]研究顯示，IL-17在乙型肝炎相關(guān)代謝失調(diào)肝硬化患者和CCl4處理過的大鼠中明顯增加。經(jīng)自體骨髓干細(xì)胞移植后患者體內(nèi)和CCl4處理過的大鼠IL-17明顯下降，證明自體骨移植通過下調(diào)IL-17在肝臟疾病中發(fā)揮著積極作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)TGF-β1是導(dǎo)致肝纖維化最關(guān)鍵的細(xì)胞因子。國內(nèi)外學(xué)者在肝纖維化疾病的研究中證明了TGF-β1在肝纖維化形成、發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，其能抑制肝細(xì)胞的增殖、激發(fā)HSCs的活化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的凋亡。研究表明，TGF-β1水平在纖維病變的區(qū)域明顯提高。實驗性抗TGF-β1的治療能抑制纖維化的形成，Liu等[12]證明TGF-β1與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。研究中顯示，封閉 TGF-β可明顯抑制纖維化，目前TGF-β1中和抗體已經(jīng)在包括肝纖維化在內(nèi)的各種疾病治療中得到廣泛應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的肝細(xì)胞生長因子是存在于急性肝損傷動物血漿中的蛋白因子，它能刺激肝細(xì)胞的DNA合成，且在肝再生過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示，肝細(xì)胞生長因子可促進(jìn)干細(xì)胞的遷移及肝細(xì)胞分化[13]。

2.3促進(jìn)膠原纖維的降解基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是一簇鋅依賴性蛋白酶，主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)。其活性與金屬蛋白酶組織抑制劑有關(guān)。肝硬化時活化的HSCs和分泌的金屬蛋白酶組織抑制劑增加，抑制MMPs的活性，從而使肝組織內(nèi)膠原纖維大量增加。移植的BMSC高表達(dá)膜Ⅰ型MMP[14]。膜Ⅰ型MMP可將間質(zhì)內(nèi)的膠原降解為明膠，MMP-2可降解明膠和Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原，MMP-9特異性降解Ⅲ型膠原和明膠，從而控制肝纖維化的進(jìn)展[15]。BMSCs移植后對膠原纖維降解起核心作用的MMP-9表達(dá)明顯升高，從而提高肝臟的再生能力。Tanimoto等[16]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過調(diào)節(jié)體液因素(TNF-α和TGF-β1)的表達(dá)抑制HSCs的激活，增加MMP-9，從而有助于抑制激活的HSCs改善纖維化。

2.4有利于肝細(xì)胞再生相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在特定的培養(yǎng)條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型發(fā)生改變，發(fā)揮的新陳代謝方面的功能類似于肝細(xì)胞，推測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可以分化為肝樣細(xì)胞[17]。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為肝細(xì)胞，且可促進(jìn)肝硬化行門靜脈栓塞術(shù)后的殘肝再生。其機(jī)制可能是通過減輕肝硬化、上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、IL-10、MMP-9基因的表達(dá)改善微環(huán)境。肝細(xì)胞的再生與肝臟的損傷修復(fù)密切相關(guān)。直接移植間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)可分化為肝細(xì)胞但數(shù)量極低。間充質(zhì)干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞不到肝組織的1%[19]，因此對于肝功能再生極其有限。基于以上原因，Yagi等[20]將小鼠的BMSCs在體外經(jīng)肝細(xì)胞生長因子培養(yǎng)2周后行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組織化學(xué)分析，檢測顯示，BMSCs表達(dá)清蛋白mRNA和蛋白質(zhì)的產(chǎn)物，并分化為肝實質(zhì)樣細(xì)胞。

2.5參與組織損傷的修復(fù)和改善微環(huán)境肝硬化時肝內(nèi)纖維組織的沉積導(dǎo)致門靜脈血流障礙[21-22]，從而限制了肝臟的增生。因此，可通過提高局部血供間接激活肝細(xì)胞增生促進(jìn)肝再生。研究顯示，BMSCs在各種疾病的治療中可明顯提高局部微循環(huán)或分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。在心肌梗死模型中移植BMSCs，梗死心肌組織內(nèi)血管的生成明顯增加，血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)明顯升高[23]。血管內(nèi)皮生長因子是血管生成的核心因子之一，該因子的增加有利于肝臟內(nèi)局部血管的增加，從而改善微循環(huán)，提高內(nèi)源性細(xì)胞的血液供應(yīng)[24]。

2.6細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路目前相關(guān)研究已證實，Wnt/β-catenin 信號家族調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖、分化，在細(xì)胞的發(fā)展和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中有重要作用[25-26]。研究顯示，Wnt/β-catenin與TGF-β/Smad信號通路通過β-catenin存在交叉，因此推測封閉TGF-β1信號能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，從而進(jìn)一步增強(qiáng)自體BMSCs移植促肝臟再生的效果[27-29]。研究表明，在間充質(zhì)干細(xì)胞表面TGF-β通過激活TGF-β受體Ⅰ、Ⅱ，磷酸化激活Smad3使間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞中Smad3-β-catenin復(fù)合物解離，增加胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的β-catenin含量及向胞核內(nèi)遷移，從而可能產(chǎn)生與Wnt/β-catenin信號通路相似的作用[29]。

3間充質(zhì)干細(xì)胞在肝硬化中的應(yīng)用進(jìn)展

3.1在慢性肝損傷動物模型中的應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞被證實可減少纖維炎癥反應(yīng)，有研究報道其可抑制肝纖維化進(jìn)程。最近在體外預(yù)分化的肝樣細(xì)胞成功被用于治療肝纖維化[30]，其機(jī)制是通過分泌基質(zhì)金屬蛋白起到抗纖維化的作用[31]。Zhao等[32]觀察發(fā)現(xiàn)，將間充質(zhì)干細(xì)胞注入大鼠體內(nèi)，抗炎性因子IL-10水平增加，IL-1β、IL-6、TGF-β、TNF-α水平降低。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞可特異性或非特異性減少慢性肝損傷局部的炎癥反應(yīng)。總的來說，BMSCs移植在齲齒類動物的肝纖維化中起保護(hù)性作用，但其作用機(jī)制仍不明確。另一方面也有研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞移植在慢性肝損傷模型中沒有明顯的作用，甚至有研究表明其可導(dǎo)致在組織纖維化。Carvalho等[33]將間充質(zhì)干細(xì)胞注入到肝纖維化的大鼠體內(nèi)并沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶和清蛋白有明顯的變化。將來源于人臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞注射到硫代乙酰胺所致的肝硬化的大鼠尾靜后出現(xiàn)了相似的結(jié)果[34]。

3.2治療肝臟疾病的臨床試驗盡管BMSCs在動物實驗中仍有爭議，但大量的臨床試驗已經(jīng)開始研究間充質(zhì)干細(xì)胞的治療潛力。2013年3月美國國立衛(wèi)生研究院一項研究篩選出了282例試驗者進(jìn)行了間充質(zhì)干細(xì)胞治療，其中有22例是肝硬化患者，6例是急性肝衰竭的患者。在試驗的第一階段，4例代謝性肝硬化患者在通過肘靜脈注射自體骨髓干細(xì)胞移植的12個月后沒有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)[35]。在第二階段的研究中，Amer等[36]將40例丙型肝炎后肝衰竭患者隨機(jī)分成兩組，第一組將事先分化為肝樣細(xì)胞的自體骨髓干細(xì)胞注入到體內(nèi)，另一組接受支持治療。2周后，與傳統(tǒng)治療組比較，干細(xì)胞組患者Child及終末期肝病模型評分明顯改善，并且保持了6個月。El-Ansary等[37]將髂骨來源的自體骨髓干細(xì)胞移植到丙型肝炎導(dǎo)致的肝硬化患者體內(nèi)，結(jié)果顯示，終末期肝病模型評分>12分。在以上的這些研究中存在一個普遍問題，即缺乏相關(guān)的間充質(zhì)干細(xì)胞注射到體內(nèi)的定居情況方面的數(shù)據(jù)。Gholamrezanezhad等[38]將1118-羥基喹啉標(biāo)記過的間充質(zhì)干細(xì)胞通過外周靜脈注射到肝硬化患者體內(nèi)，觀察到注射20 min后間充質(zhì)干細(xì)胞在肺組織中達(dá)高峰，10 d后在肝脾組織中逐漸上升，表明間充質(zhì)干細(xì)胞不僅僅局限于肺組織，也通過外周靜脈注射到達(dá)肝臟。以上的研究表明,間充質(zhì)干細(xì)胞移植后對患有肝臟疾患者的肝具有輕度的生物學(xué)改善，但是沒有相關(guān)證據(jù)表明間充質(zhì)干細(xì)胞移植對于臨床上有明確的和顯著益處。Mohamadnejad等[39]的隨機(jī)對照試驗中篩選了27例患者，15例接受間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞移植，12例接受安慰劑治療，結(jié)果顯示，對肝硬化患者通過外周靜脈行骨髓干細(xì)胞移植未發(fā)現(xiàn)肝功能有明顯改善，但也說明進(jìn)一步的研究還需大樣本進(jìn)一步明確。

4BMSCs治療肝硬化的移植途徑和安全性研究進(jìn)展

4.1移植途徑目前骨髓干細(xì)胞肝臟移植應(yīng)用最多的方法包括經(jīng)肝動脈、門靜脈、外周靜脈3種。

肝動脈移植是在影像設(shè)備引導(dǎo)下經(jīng)股動脈穿刺，將導(dǎo)管開口移至肝動脈處，然后將骨髓干細(xì)胞緩慢注入到肝臟病變部位。該途徑可方便地將分離純化后的間充質(zhì)干細(xì)胞懸液直接輸注至肝臟。由于介入治療的廣泛開展，對其技術(shù)掌握很熟練，不受細(xì)胞濃度及數(shù)量的影響，移植創(chuàng)傷較小且可以移植較大數(shù)量的細(xì)胞，此方法在骨髓干細(xì)胞移植中應(yīng)用較多，因此在中國臨床上大多采用此途徑[40]。

門靜脈移植多為經(jīng)皮肝內(nèi)門靜脈移植。從生理學(xué)角度看，門靜脈是肝臟的營養(yǎng)靜脈，肝臟本身的微循環(huán)也可以調(diào)節(jié)其分化。但在肝硬化狀態(tài)下由于門靜脈壓力較高，通過門靜脈移植的干細(xì)胞由于門靜脈高壓的阻力存在，使其進(jìn)入肝實質(zhì)的速度受限而不能較快地進(jìn)入并均勻分布在肝實質(zhì)內(nèi)部。而且一次注射大量細(xì)胞易在門靜脈形成微血栓，為降低栓塞等并發(fā)癥的發(fā)生，需要考慮控制BMSCs的數(shù)量。

外周靜脈移植是通過外周靜脈直接將干細(xì)胞注入體內(nèi)通過血液循環(huán)后進(jìn)入肝臟。此方法操作簡單，患者的痛苦小。王方等[41]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)門靜脈和肝動脈移植自體骨髓干細(xì)胞療效相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明移植途徑可能并不影響最終的治療效果。熊全等[42]研究發(fā)現(xiàn)，3種移植方法對治療肝硬化模型大鼠均有效，且效果相似。

以上3種途徑各有利弊，在實際應(yīng)用中需根據(jù)患者的自身情況選擇合適的移植方式，以便達(dá)到最佳治療效果。

4.2安全性評估由于間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝臟疾病的機(jī)制未能完全闡明，骨髓干細(xì)胞移植的安全性一直是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的問題，其中致瘤性及傳播病毒是最主要的問題。Kharaziha等[43]對8例肝硬化患者進(jìn)行了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞門靜脈輸注的Ⅰ～Ⅱ期臨床試驗，觀察其對患者的肝功能改善情況。在隨訪的24周中未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。Zhang等[44]在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植的試驗中觀察患者肝功能和腹水的改善情況，結(jié)果顯示，31例接受人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈輸注的患者中有4例在輸注后2～6 h內(nèi)出現(xiàn)自限性發(fā)熱(37～38 ℃)現(xiàn)象，未行相關(guān)處理12 h內(nèi)體溫恢復(fù)正常，無其他不良反應(yīng)和并發(fā)癥。一項大規(guī)模的研究顯示700例接受自體骨髓干細(xì)胞移植的受試者中沒有發(fā)現(xiàn)包括造血或?qū)嶓w腫瘤在內(nèi)的不良反應(yīng)[45]。雖然目前相關(guān)文獻(xiàn)未報道嚴(yán)重的與自體干細(xì)胞移植相關(guān)的不良反應(yīng)及并發(fā)癥，但對于移植后的長期療效還缺乏相關(guān)報道，尚需進(jìn)一步研究。

5問題與展望

目前骨髓干細(xì)移植治療肝纖維化的研究雖然取得了一定的成效，但其仍存在許多懸而未決的技術(shù)性難題，如干細(xì)胞的分離鑒定、移植的適應(yīng)證、禁忌證、長期的療效觀察等，而這些問題的解決對于干細(xì)胞移植的順利進(jìn)行至關(guān)重要。而且由于其治療的安全性、理論體系的不完善、技術(shù)手段的局限性、倫理道德方面的爭議等諸多未解的難題，干細(xì)胞研究處于讓人無限期待又被不斷質(zhì)疑的糾結(jié)之中。干細(xì)胞移植是前沿研究，在研究的初始階段每一個探索都可能存在缺陷，任何技術(shù)和方法都有一個從不完善到完善的過程。對于某些發(fā)生率和病死率缺乏特異性有效治療手段的疾病應(yīng)該在確保安全的前提下鼓勵和支持探索創(chuàng)新。干細(xì)胞移植為肝硬化等肝病患者提供了新的希望，為肝硬化治療開辟了新的途徑，有巨大的臨床應(yīng)用前景。隨著生命科學(xué)的全面發(fā)展，干細(xì)胞領(lǐng)域中的認(rèn)識誤區(qū)將逐步得到澄清，干細(xì)胞科學(xué)也必將健康地發(fā)展起來。

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摘要：臨床上大多數(shù)慢性肝病最終發(fā)展為肝硬化。肝硬化進(jìn)入失代償后將導(dǎo)致肝功能衰竭，目前最有效的方法是肝移植，但由于供體短缺以及移植后相關(guān)的一系列并發(fā)癥，導(dǎo)致患者生存質(zhì)量不盡如人意。在此背景下以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的移植療法成為當(dāng)前國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點之一，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝硬化具有一定的效果。現(xiàn)對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基因移植治療的原理、治療方法和治療現(xiàn)狀及其發(fā)展前景作一綜述,旨在為其進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：肝硬化；骨髓干細(xì)胞；干細(xì)胞移植

Research Progress in Mesenchymal Stem Cell Transplantation in Patients with Liver CirrhosisYIMin,FUBi-mang,ZHANGJie.(DepartmentofHepatobiliarySurgery,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650000,China)

Abstract:Liver cirrhosis is the most common pathological outcome of chronic liver disease.Cirrhosis of the liver after decompensation will lead to liver failure.Currently,the most effective method is liver transplantation.However,the quality of life of patients is unsatisfactory due to the shortage of donor and a series of transplantation related complications.In this context,the transplantation therapy based on stem cell has become one of the research hot topics at home and abroad,among which bone marrow mesenchymal stem cell transplantation has certain effect in the treatment of liver cirrhosis.Here reviews the therapeutic methods and principles,status and development prospect of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation,so as to provide theoretical basis for its further application.

Key words:Liver cirrhosis; Bone marrow stem cells; Stem cell transplantation

收稿日期：2014-10-20修回日期：2014-12-28編輯：伊姍

基金項目：云南省衛(wèi)生科技計劃項目(2012WS0078)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.15.014

中圖分類號：R319

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)15-2725-04