血漿DLC-1甲基化與肝細(xì)胞性肝癌患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系*

劉 艷，蓋 領(lǐng)，茅國(guó)新

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤化療科，江蘇226001）

血漿DLC-1甲基化與肝細(xì)胞性肝癌患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系*

劉 艷**，蓋 領(lǐng)，茅國(guó)新

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤化療科，江蘇226001）

目的：研究肝細(xì)胞性肝癌患者血漿DLC-1甲基化狀態(tài)，研究其與各臨床相關(guān)因素的關(guān)系及對(duì)肝細(xì)胞性肝癌患者預(yù)后的意義。方法：采用甲基化特異性PCR法檢測(cè)肝細(xì)胞性肝癌患者和健康人群血漿中提取DNA的DLC-1甲基化狀態(tài)，結(jié)合臨床特征（性別、年齡、肝硬化、AFP水平、HbsAg及臨床分期），分析DLC-1甲基化狀態(tài)與肝細(xì)胞性肝癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：96例肝細(xì)胞性肝癌患者血漿中DLC-1甲基化陽(yáng)性率為30.2%，對(duì)照健康組無(wú)甲基化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。肝細(xì)胞性肝癌患者血漿DLC-1甲基化狀況與性別、年齡、抗-HBV、肝硬化無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），與HBsAg、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)（P＜0.05）。DLC-1甲基化陽(yáng)性組較陰性組轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高，存活率較甲基化陰性組低。結(jié)論：DLC-1基因甲基化狀態(tài)與肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)肝細(xì)胞性肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)具有重要的價(jià)值，有望成為評(píng)估肝細(xì)胞性肝癌預(yù)后的有效指標(biāo)。

甲基化；DLC-1；肝細(xì)胞性肝癌；預(yù)后

近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明基因的異常甲基化與肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后存在緊密關(guān)聯(lián)，可能對(duì)肝細(xì)胞性肝癌的診斷、治療以及預(yù)后具有重要價(jià)值[5-6]。有研究表明DLC-1基因在肝細(xì)胞性肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌中常低表達(dá)或缺失，DLC-1基因DNA啟動(dòng)子甲基化的改變通常是腫瘤抑制基因未被激活、蛋白未發(fā)揮其作用的重要機(jī)制[7]。DLC-1全稱為肝癌缺失基因1，定位于人類染色體8p22，目前認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因，DLC-1 DNA啟動(dòng)子甲基化的改變通常是作為腫瘤抑制基因未被激活的重要機(jī)制[8-9]。本實(shí)驗(yàn)通過甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)檢測(cè)分析DLC-1基因在肝細(xì)胞性肝癌患者血漿中甲基化狀態(tài)，分析血漿甲基化狀態(tài)與HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2008年3月—2009年10月間接受肝細(xì)胞性肝癌手術(shù)患者96例外周血，術(shù)后組織標(biāo)本均經(jīng)過病理證實(shí)，所有病例均有完整的臨床及隨訪資料，包括男75例，女性21例，抽血均在患者初入院時(shí)；96例健康體檢者為健康對(duì)照組，男72例，女24例，2組人員均空腹抽取外周靜脈血（抗凝），血液標(biāo)本5mL，離心5～10分鐘，取上層血漿，-80℃低溫冰箱凍存或立即提取DNA。所有患者入組前均經(jīng)知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 Takara（寶生物工程大連公司）DNA提取試劑盒；EZ DNA甲基化試劑盒（北京天漠公司）；2XTag PCR MasterMix（北京天根公司）；Marker（北京天根公司）；美國(guó)Bio-rad瓊脂糖。

1.3 MSP方法 從患者和健康體檢者血漿中提取DNA，設(shè)計(jì)合成MSP引物，PCR反應(yīng)體系：引物3μL，模板 3μL，10×PCR緩沖液 2.5μL，2.0mmol/L 4× dNTP混合物0.5μL，TaKaRaTM熱啟動(dòng)Taq 0.5μL，25mmol/L MgCl22μL，甲基化擴(kuò)增體系總體積為14.5μL。PCR反應(yīng)過程：預(yù)變性95°C 12分鐘，40個(gè)循環(huán)變性94°C 15秒，退火55°C 30秒，延伸72°C 40秒，延伸72°C 10分鐘,甲基化擴(kuò)增體系除了退火溫度提高到56°C外其他均相同。判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）甲基化特異性引物擴(kuò)增出目的條帶，非甲基化特異性引物無(wú)條帶擴(kuò)增出，判斷為甲基化；（2）非甲基化特異性引物擴(kuò)增出目的條帶，甲基化引物無(wú)條帶擴(kuò)增出，判斷為非甲基化；（3）2對(duì)引物均擴(kuò)增出目的條帶，這種情況稱為半甲基化或部分甲基化，也判斷為甲基化。

根據(jù)GenBank的甲基化引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成：

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本組資料采用EpiData 3.02軟件錄入數(shù)據(jù),SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料差異性比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，生存檢驗(yàn)采用Log-rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。單因素和多因素COX回歸分析計(jì)算比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI）。

2 結(jié) 果

2.1 MSP檢測(cè)HCC患者血漿DLC-1甲基化狀態(tài)在肝細(xì)胞性肝癌患者DLC-1血漿甲基化率為30.2%（29/96），正常對(duì)照人群中均未有甲基化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DLC-1基因啟動(dòng)子甲基化與96例肝細(xì)胞性肝癌患者的臨床特征關(guān)系見表1，肝細(xì)胞性肝癌患者血漿DLC-1基因甲基化狀態(tài)與HBsAg是否陽(yáng)性、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。在肝細(xì)胞性肝癌患者中，HBsAg陰性者DLC-1甲基化陽(yáng)性率顯著高于HBsAg陰性者（P= 0.024）；腫瘤＜6cm者DLC-1甲基化陽(yáng)性率顯著高于腫瘤＞6cm者（P=0.01）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者甲基化陽(yáng)性率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P=0.041）；晚期患者甲基化率顯著高于早期患者（P=0.013），而與患者年齡、性別、抗-HBV狀態(tài)、AFP水平及是否肝硬化間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 DLC-1甲基化狀態(tài)與預(yù)后的關(guān)系 隨訪96例肝細(xì)胞性肝癌患者是否發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)或死亡，部分患者未完全按照指定時(shí)間進(jìn)行復(fù)查，直至病情嚴(yán)重時(shí)才得以確定復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，故以發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的具體時(shí)間為入院確診當(dāng)天。其中5例失訪，截尾數(shù)據(jù)認(rèn)為失訪患者死亡。96例肝細(xì)胞性肝癌患者中位無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）為8.2月，總生存期為17.5月。

表1 甲基化狀態(tài)與肝細(xì)胞性肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系

對(duì)96例肝細(xì)胞性肝癌患者隨訪12個(gè)月，DLC-1甲基化陽(yáng)性患者死亡率為89.65%（26/29），DLC-1甲基化陰性患者，疾病進(jìn)展率為26.87%（18/ 67），死亡率73.13%（49/67）；DLC-1甲基化陽(yáng)性患者與陰性患者PFS分別為5.1月和7.1月，OS分別為14.7月和25.8月，DLC-1甲基化陽(yáng)性患者PFS、OS均短于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1、2）。

圖1 DLC-1甲基化陽(yáng)性與陰性肝細(xì)胞性肝癌患者PFS曲線圖

圖2 DLC-1甲基化陽(yáng)性與陰性肝細(xì)胞性肝癌患者OS曲線圖

2.3 相關(guān)因素對(duì)肝細(xì)胞性肝癌患者預(yù)后影響的COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析 將患者性別、年齡、肝硬化、AFP水平、臨床分期、甲基化表達(dá)情況采用COX模型進(jìn)行多因素回歸分析，結(jié)果顯示除腫瘤大小、TNM分期外（OR=2.366，OR=2.590），血漿DLC-1基因甲基化表達(dá)也是影響患者PFS及OS的獨(dú)立因素，相對(duì)危險(xiǎn)度分別為4.343（P＜0.05），見表2。

表2 肝細(xì)胞性肝癌多因素生存分析結(jié)果

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段的復(fù)雜過程，涉及多種基因的功能異常，基因表觀遺傳學(xué)改變?cè)谀[瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。其中DNA甲基化是目前研究最廣泛、也是最重要的表觀遺傳修飾形式之一。DNA甲基化是指將腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，CpG二核苷酸中的胞嘧啶環(huán)上5′位置的氫被活性甲基所取代，從而轉(zhuǎn)變成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的生物過程。正常的甲基化對(duì)于維持機(jī)體的功能是必需

的，但通過對(duì)DNA甲基化模式的研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)基因異常的DNA甲基化狀態(tài)存在于包括肝細(xì)胞性肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中，隨著對(duì)肝細(xì)胞性肝癌的抑癌基因及其影響因素等研究的深入，DLC-1異常甲基化研究日益受到重視[10-11]。

DLC-1基因通過GTP酶活性抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，抑制了一些癌基因的作用元件，從而在原發(fā)性肝癌中執(zhí)行抑制癌細(xì)胞增殖的功能[12]；DLC-1基因表達(dá)產(chǎn)物為RhoA和Cdc42特異性的GTP酶激活蛋白，主要通過下調(diào)Rho的活性而抑制腫瘤，與調(diào)控細(xì)胞增殖和粘附的信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)系密切[13]，而DNA啟動(dòng)子甲基化的改變通常是腫瘤抑制基因未被激活的重要機(jī)制。

我們將包括年齡、性別、肝硬化、腫瘤大小等在內(nèi)的臨床參數(shù)資料與DLC-1甲基化進(jìn)行了研究。與HbsAg相關(guān)性研究提示，DLC-1基因甲基化狀態(tài)與HBV感染有著顯著的關(guān)聯(lián)性（P=0.024）。DLC-1基因甲基化在HBV感染的肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生發(fā)展過程中可能的重要作用，其臨床意義有待于進(jìn)一步探討。與臨床分期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤的大小、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與肝細(xì)胞性肝癌甲基化顯著相關(guān)，腫瘤越大，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目越多，DLC-1甲基化越頻繁（P＜0.05）。此外，TNM分期與DLC-1甲基化也顯著相關(guān)，TNM III～Ⅳ期患者中的甲基化頻率顯著高于TNM I～Ⅱ期患者，且甲基化狀態(tài)呈現(xiàn)明顯增加的趨勢(shì)，提示抑癌基因DLC-1甲基化是肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生的早期分子事件，隨著腫瘤的進(jìn)展表達(dá)增高（P= 0.013）。其它臨床特征如腫瘤患者年齡、性別及肝硬化、AFP水平等臨床特征與甲基化差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于在本研究中的例數(shù)較少，未檢測(cè)其肝硬化、AFP水平等臨床參數(shù)與DLC-1甲基化表達(dá)的關(guān)系，有待進(jìn)一步加大樣本量研究。

本實(shí)驗(yàn)探討了DLC-1基因甲基化與肝細(xì)胞性肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)系，結(jié)果提示DLC-1甲基化與肝細(xì)胞性肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，DLC-1甲基化可能是預(yù)測(cè)肝細(xì)胞性肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一個(gè)獨(dú)立的新的危險(xiǎn)因素，但由于標(biāo)本量和人群種族的限制，今后還需要大規(guī)模多中心的研究加以證實(shí)。

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Expression and clinical significance of DLC-1 DNA methylation in hepatocellular cancer

LIU Yan,GAI Ling,MAO Guoxin
(Department of Oncology,the Affiliated Hospital of Nantong University,Jiangsu 226001)

Objectives:To analyze the relationship between the promoter region DLC-1 DNA methylation status and the characteristics in hepatocellular cancer,and explore the role of DLC-1 DNA methylation in the occurrence and metastasis of hepatocellular cancer.Methods:96 cases of hepatocellular cancer specimens were selected,the methylation specific-PCR(MSP)was used to detect the tumor suppressor gene DLC-1 methylation in the above-mentioned tissues.To explore their roles of them in the occurrence and development of hepatocellular cancer,and the relationship associated with the clinical relevant factors.And to further analyze of the relationship between the promoter region of DLC-1 methylation status and the characteristics of methylation of the genome-wide in hepatocellular cancer.Disscussion the relationship between the methylation status with clinicopathologic factors(sex,age,AFP,differentiation degree,clinical stage,)and progression-free survival(PFS)as well as overall survival(OS)was analyzed.Results:The methylation status of DLC-1 in plasma of hepatocellular cancer patients was 30.1%.There were no correlations among the DLC-1 methylation status in hepatocellular cancer plasma and the patient's sex,age,cirrhosis and anti-HBV(P＞0.05),but it was correlated with degrees of differentiation TNM staging.Multivariate analysis indicated that besides the tumor size,the methylation status is also an independent risk factor influencing recurrence,also independently correlated with TTP and OS in hepatic patients. Conclusions:DLC-1 methylation shows great importance in the field of judging the prognosis.Tumor suppressor gene DLC-1 methylation is an early molecular index of hepatocellular cancer.

methylation;DLC-1;hepatocellular carcinoma;prognosis

R735.7

A

江蘇省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目（H200957）。

2015-09-19

1006-2440（2015）05-0443-04

**[作者簡(jiǎn)介]劉艷，女，漢族，江蘇鹽城人，生于1985年12月，碩士研究生。研究方向：惡性腫瘤化學(xué)治療。 通信作者：茅國(guó)新，E-mail：MAOGX33@163.com

肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的肝臟惡性腫瘤，占全球腫瘤發(fā)生率的第五位[1]，其發(fā)生發(fā)展涉及染色體畸變、基因突變、表觀遺傳學(xué)改變、生長(zhǎng)因子異常分泌和多種信號(hào)通路異常激活。表觀遺傳修飾主要包括DNA以及一些與DNA密切相關(guān)的蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾，如DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑以及非編碼RNA等，其中DNA甲基化（methylation）是目前研究最廣泛、也

是最重要的表觀遺傳修飾形式之一[2-4]。