腫瘤干細(xì)胞的靶向策略研究

羅晶婧，廖 雪，廖端芳，何 丹，何迎春

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西結(jié)合學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208)

當(dāng)前針對(duì)惡性腫瘤的治療策略具有一定的局限性，治療無(wú)效的情況經(jīng)常出現(xiàn)。多數(shù)惡性腫瘤治療失敗的原因是對(duì)化療和放療的抵抗以及腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。這些問(wèn)題的出現(xiàn)與腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)密切相關(guān)，而很多治療方法對(duì)大部分時(shí)間處于靜止?fàn)顟B(tài)的CSC 無(wú)效，并且也不是有選擇性地針對(duì)腫瘤細(xì)胞，對(duì)健康組織也產(chǎn)生一定的傷害，故腫瘤患者通常會(huì)面臨復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。因此，如何消除CSC 成為治療惡性腫瘤的關(guān)鍵。

近年來(lái)，多種以直接殺滅CSC 或改變滋生CSC 微環(huán)境為目標(biāo)的治療策略已被設(shè)計(jì)出來(lái)。表面標(biāo)志物的微妙差異和信號(hào)通路的變化都成為了治療靶標(biāo)的研究熱點(diǎn)。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)潛在的CSC 治療靶標(biāo)，包括ABC 家族、抗凋亡因子和各類致癌信號(hào)通路(如Wnt/β－蛋白、Hedgehog 和Notch 通路等)。靶向腫瘤細(xì)胞亞群自我更新、轉(zhuǎn)移的能力和耐藥性、抗輻射性的治療策略可以有效治療惡性腫瘤。因此，本文簡(jiǎn)要介紹了CSC 模式，總結(jié)了專門靶向CSC 的治療策略。

1 CSC 模式

關(guān)于腫瘤的無(wú)限增殖和腫瘤異質(zhì)性，已有2 種不同的模式可以解釋:CSC 模式和克隆進(jìn)化模式。CSC模式認(rèn)為在實(shí)體腫瘤中存在一種腫瘤細(xì)胞亞群，該亞群細(xì)胞具有類似干細(xì)胞的功能，克隆潛力高，具有形成腫瘤的能力，所以將其稱為CSC。CSC 模式認(rèn)為:腫瘤的啟動(dòng)、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，主要取決于腫瘤中稀少的CSC;同一腫瘤中不同腫瘤細(xì)胞之間的異質(zhì)性和層次結(jié)構(gòu)是由CSC 的不對(duì)稱分裂所導(dǎo)致。在這個(gè)模式中，腫瘤是由多層腫瘤細(xì)胞組成的高度層次化的結(jié)構(gòu)，其中具備獨(dú)特自我更新能力的細(xì)胞群位于該層次結(jié)構(gòu)的最頂部，而其他包括大部分腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞都由CSC 分化形成［1］。Gregory Driessens 等［2］通過(guò)遺傳譜系示蹤法發(fā)現(xiàn)良性乳頭狀瘤中大多數(shù)腫瘤細(xì)胞只有有限的增殖潛能，僅有一小部分具有長(zhǎng)期存活的能力，其增殖產(chǎn)生的后代占據(jù)了腫瘤的絕大部分。

關(guān)于腫瘤的形成，克隆進(jìn)化模式［3］認(rèn)為:首先，某個(gè)功能正常的細(xì)胞被誘導(dǎo)或自發(fā)的發(fā)生基因變異引起了腫瘤細(xì)胞的異常增殖;隨后，腫瘤細(xì)胞的隨機(jī)基因變異產(chǎn)生帶有適應(yīng)性的新突變細(xì)胞。緊接著，這些變異細(xì)胞群接受了選擇性淘汰:絕大多數(shù)基因變異的細(xì)胞不是在資源競(jìng)爭(zhēng)中被淘汰，就是被機(jī)體免疫細(xì)胞消滅，只有極個(gè)別向著有利于選擇腫瘤細(xì)胞方向發(fā)展的變異細(xì)胞存活下來(lái)，從而發(fā)展成了占主導(dǎo)地位的腫瘤細(xì)胞亞群。這一模式類似于達(dá)爾文的自然選擇學(xué)說(shuō)。通過(guò)這一系列多樣性和選擇性循環(huán)，腫瘤不斷發(fā)展，最終形成了惡性腫瘤。其中所有腫瘤細(xì)胞的增殖潛力是等效的，都發(fā)揮了促進(jìn)腫瘤異質(zhì)性和維持腫瘤存活的作用;基因變異導(dǎo)致子克隆的多樣性，最終形成了腫瘤發(fā)展過(guò)程中腫瘤細(xì)胞間的異質(zhì)性。

總體來(lái)說(shuō)，CSC 模式提出腫瘤中存在固有的具有自我更新、分化、增殖能力的CSC，腫瘤異質(zhì)性由CSC分化引起。其強(qiáng)調(diào)普通腫瘤細(xì)胞和CSC 的不同功能，卻沒(méi)有考慮細(xì)胞內(nèi)的基因變異產(chǎn)生基因多樣化的子克隆。而克隆進(jìn)化模式側(cè)重于關(guān)注基因變異引起的腫瘤異質(zhì)性，卻忽略了單個(gè)細(xì)胞克隆可能發(fā)生的功能變化。這2 種模式并不是相互排斥的，腫瘤細(xì)胞包括CSC 自身，在腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中，也要經(jīng)歷基因變異和選擇，發(fā)生克隆進(jìn)化。

1997年，Bonnet 等［4］從人急性髓細(xì)胞性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)細(xì)胞中分離出了少量特異性表達(dá)表面標(biāo)志物CD34+和CD38－的白血病干細(xì)胞，并將其移植到非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些僅占腫瘤細(xì)胞總數(shù)0.2%的細(xì)胞形成了穩(wěn)定的腫瘤，這項(xiàng)研究通過(guò)移植實(shí)驗(yàn)有力地證明了CSC 的存在性。隨后，CSC在不同實(shí)體瘤中的存在被廣泛報(bào)道:包括肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌、腦癌和黑素瘤等。

2 CSC 的表面標(biāo)志物

2.1 CSC 的表面標(biāo)志物 由于CSC 與腫瘤形成、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性有著密切聯(lián)系，如何從腫瘤細(xì)胞中分離出這些細(xì)胞成為需要深入研究的課題。研究表明，利用一些特有的表面標(biāo)志物可以從腫瘤細(xì)胞和正常干細(xì)胞中鑒定出CSC?，F(xiàn)在，最普遍用來(lái)鑒別CSC 的方法是借助流式細(xì)胞儀，根據(jù)細(xì)胞表面的特殊標(biāo)志物和細(xì)胞內(nèi)的分子進(jìn)行熒光激活來(lái)篩選細(xì)胞。

最先發(fā)現(xiàn)也是研究最透徹的干細(xì)胞白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells，LSCs)特異表達(dá)CD34+和CD38－表面標(biāo)志物。盡管正常造血干細(xì)胞和白血病干細(xì)胞都出現(xiàn)了CD34 表達(dá)的增加，但是CD38 表達(dá)的減少仍然可以使白血病干細(xì)胞區(qū)別于正常造血干細(xì)胞。隨后，越來(lái)越多選擇性較好的白血病干細(xì)胞的表面標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合運(yùn)用這些表面標(biāo)志物使白血病干細(xì)胞的鑒別更準(zhǔn)確。比如，在白血病干細(xì)胞中能同時(shí)出現(xiàn)CD34+、CD38－、HLA-DR－、CD71－、CD90－、CD117－和CD123+的特異表達(dá)，而在正常造血干細(xì)胞中沒(méi)有［5］。Shen 等［6］發(fā)現(xiàn)鼻咽癌干細(xì)胞可能存在于CD44+腫瘤細(xì)胞群中。他們證實(shí)了CD44+細(xì)胞比CD44－細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖能力和致瘤潛力。這表明，CD44+可作為尋找鼻咽癌干細(xì)胞的重要表面標(biāo)志物。

在實(shí)體腫瘤方面，在NOD/SCID 小鼠上接種具有ESA+、CD44+、CD24－/low Lineage－的細(xì)胞群比其他細(xì)胞群具有更強(qiáng)的成瘤能力，將具有這種表面標(biāo)志物的細(xì)胞認(rèn)定為乳腺癌干細(xì)胞。最近，Qiu 等［7］在NOD/SCID 小鼠上分別接種了CD34+、CD38－、CD123+、N－鈣黏蛋白+細(xì)胞群和CD34+、CD38－、CD123+、Tie2+細(xì)胞群，成功誘發(fā)了白血病。這提示，在白血病發(fā)展過(guò)程中，N－鈣黏蛋白+和Tie2+可以作為鑒定白血病干細(xì)胞的重要表面標(biāo)志物。

盡管對(duì)CSC 表面標(biāo)志物的研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，但是仍然有很多問(wèn)題沒(méi)有解決:不是所有的腫瘤都表達(dá)標(biāo)志物，而且一些非CSC 的腫瘤細(xì)胞也可能表達(dá)標(biāo)志物。因此，CSC 的表面標(biāo)志物可以用來(lái)鑒別富含CSC 的腫瘤細(xì)胞亞群，但未必能明確分離出所有的CSC。按照不同的腫瘤類型，本綜述匯總了部分CSC表面標(biāo)志物(表1)。

表1 不同腫瘤類型的CSC 表面標(biāo)志物

2.2 靶向細(xì)胞表面標(biāo)志物 為了提高治療策略的針對(duì)性，研究人員選擇性靶向腫瘤表面標(biāo)志物、抗腫瘤表面標(biāo)志物的配體或抗體。開(kāi)發(fā)靶向CSC 的單克隆抗體已成為了研究的熱點(diǎn)。目前，已開(kāi)發(fā)出一種名為“吉妥珠單抗奧唑米星”的人源抗CD33 的小鼠單克隆抗體與細(xì)胞毒性劑阿奇霉素的合成制劑，并廣泛用于治療AML［19］。因?yàn)楸砻鏄?biāo)志物在正常干細(xì)胞和CSC中的表達(dá)水平存在差異，所以表面標(biāo)志物可作為治療腫瘤的特異性靶標(biāo)。如人AML 干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD44、CD123 和免疫球蛋白黏蛋白TIM-3 已成為治療AML 的靶標(biāo)［20－22］。用這些細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體治療AML 都顯著降低了白血病免疫原性，并根除了小鼠體內(nèi)的CSC。在急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中，以CD47為靶標(biāo)的CD47 抗體的表達(dá)水平比在正常細(xì)胞中的表達(dá)水平高得多，這使CD47 抗體可有效殺死白血病干細(xì)胞。最近，用CD47 的單克隆抗體與阿糖胞苷聯(lián)合治療髓細(xì)胞性白血病模型NOD/SCID 鼠，顯著消除了白血病細(xì)胞和AML 干細(xì)胞，顯示出較好的臨床研究?jī)r(jià)值［23］。在處理乳腺癌MCF-7 細(xì)胞中，研究人員將CD44 抗體與金納米棒結(jié)合，靶向顯出CSC 特征的CD44+細(xì)胞，并以光照燒蝕CD44+細(xì)胞。這樣，被燒蝕的細(xì)胞吸收近紅外光，增加了指定位置的局部溫度［24］。

此外，肺癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤CSC 都高表達(dá)CD133，而且CD133 高表達(dá)患者的臨床預(yù)后較差，外周血單核細(xì)胞CD133 的mRNA 表達(dá)水平與胃腸道間質(zhì)瘤患者的治療反應(yīng)有關(guān)，F(xiàn)eng 等［25］認(rèn)為定量檢測(cè)外周血單核細(xì)胞CD133 的mRNA 水平可以鑒定、預(yù)測(cè)腎透明細(xì)胞癌患者的癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況，這將便于按照風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)對(duì)患者進(jìn)行分組從而采取針對(duì)性的輔助治療。因此，靶向CD133 的治療方案具有良好的研究前景。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中CD133+腫瘤細(xì)胞群顯示出CSC樣特性，現(xiàn)已被公認(rèn)為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤CSC。先聯(lián)合使用碳納米管與抗CD133 的單克隆抗體，再用近紅外激光照射，能選擇性地靶向CD133+膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，并最終利用碳納米管的光熱殺死靶細(xì)胞［26］。膠質(zhì)細(xì)胞瘤神經(jīng)球中的短發(fā)夾RNA 能破壞CD133 的表達(dá)，削弱神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新能力和致瘤的能力［27］。

3 CSC 與ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體

3.1 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)家族的作用是通過(guò)水解ATP，將各種在結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的小分子，如細(xì)胞毒性藥物和色素，排出細(xì)胞外的膜轉(zhuǎn)運(yùn)體。正常干細(xì)胞和CSC 都出現(xiàn)高水平表達(dá)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體的現(xiàn)象。這導(dǎo)致進(jìn)入CSC 的大部分化療藥物和細(xì)胞毒性藥物外排，顯著減少了藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，降低了細(xì)胞間的藥物濃度，使CSC 能成功抵抗現(xiàn)有的腫瘤療法，從而最終出現(xiàn)較強(qiáng)的多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)家族中有許多成員是耐藥蛋白，包括多藥耐藥蛋白(MRPs/ABCC)，乳腺癌耐藥蛋白(BCRP/ABCG2)和P－糖蛋白(P-gp/ABCB1)［28］。通過(guò)Hoechst 33342 染色細(xì)胞可以檢測(cè)到CSC 中ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體的高表達(dá)。有少部分細(xì)胞高水平表達(dá)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體的同時(shí)外排Hoechst 色素，這部分細(xì)胞被稱為側(cè)群細(xì)胞(SP細(xì)胞)。很多細(xì)胞系和腫瘤中都包含SP 細(xì)胞，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，SP 細(xì)胞比非SP 細(xì)胞發(fā)揮更重要的作用。

3.2 靶向?qū)⑺幬锿馀诺霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ATP 泵引起的抗腫瘤藥物外排是產(chǎn)生化療抵抗的主要原因，研究者已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多方法來(lái)避免、中和、甚至利用藥物外排泵克服耐藥性。目前已開(kāi)發(fā)了幾種與ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用以抑制MDR 的藥物制劑。

首先發(fā)現(xiàn)的P-gp 外排泵(ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的一員)的抑制劑是維拉帕米，它常用于SP 分析中阻止Hoechst 的色素外排。維拉帕米和其他抗腫瘤的藥物(如阿霉素，紫杉醇或長(zhǎng)春新堿)聯(lián)合運(yùn)用已顯示出較好的治療效果。Khdair 等［29］發(fā)現(xiàn)，同時(shí)將亞甲基藍(lán)(一種P-gp 抑制劑)和阿霉素作用于帶有腺腫瘤的同系BALB/c 小鼠，可以使藥物在小鼠病灶內(nèi)的蓄積顯著增加，從而加速腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，減緩腫瘤生長(zhǎng)并顯著提高動(dòng)物的存活率。

還發(fā)現(xiàn)了很多新的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如同時(shí)抑制P-gp 和MRP1 的MS-209、VX-710 和Tariquidar等［30］。MS-209 克服MDR 方面的試驗(yàn)已經(jīng)在乳腺癌和其他實(shí)體瘤上顯示出可喜的效果。有關(guān)Tariquidar和多西紫杉醇的復(fù)合物用于治療復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性卵巢癌、宮頸癌、肺癌、腎臟惡性腫瘤的抗腫瘤研究正在進(jìn)行。Tariquidar 與阿霉素、依托泊苷、米托坦和長(zhǎng)春新堿結(jié)合對(duì)原發(fā)性、復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腎上腺皮質(zhì)癌的抗腫瘤作用也正在研究中。

另一種靶向ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體的策略是調(diào)節(jié)這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平。多壁碳納米管能通過(guò)抑制c-Myc 原癌基因，下調(diào)人結(jié)腸腺癌Caco-2 細(xì)胞中的P-gp/ABCB1 和ABCC4/MRP4 的表達(dá)，克服腫瘤耐藥性，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。這也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出以碳納米管為載體、克服ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)的MDR 的藥物遞送系統(tǒng)提供了可能［31］。

4 CSC 與關(guān)鍵信號(hào)通路

4.1 與CSC 相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路 信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)異常對(duì)于CSC 保留干細(xì)胞特性起著極其重要的作用。涉及調(diào)控CSC 和正常干細(xì)胞自我更新和分化的通路包括NF-κB、PTEN、JAK/STAT、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT、Hedgehog、Notch 等。

NF-κB 是一種調(diào)節(jié)多類基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細(xì)胞遭受刺激(如來(lái)自細(xì)胞因子、微生物抗原、自由基和紫外線照射的刺激)時(shí)，NF-κB 參與細(xì)胞的刺激應(yīng)答。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 與腫瘤發(fā)生的多個(gè)方面相關(guān)，包括通過(guò)增加生存因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。許多惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了NF-κB 的異常調(diào)節(jié)，包括淋巴瘤、白血病、乳腺癌結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌。NF-κB 的異?；罨軐?dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，引起化療耐受、慢性炎癥和自身免疫性疾?。?2］。

Notch、Hedgehog 和Wnt 信號(hào)通路在維持CSC 的生存中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Abel 等［33］發(fā)現(xiàn)，在人胰腺癌CSC 中，Notch 信號(hào)通路上的信號(hào)分子的表達(dá)被提升。而阻斷Notch 信號(hào)傳導(dǎo)，胰腺癌CSC 的比例降低，腫瘤生長(zhǎng)得到抑制。Hedgehog 信號(hào)通路中最主要的Sonic Hedgehog 通路，能通過(guò)誘導(dǎo)Snail 基因表達(dá)，促進(jìn)未分化甲狀腺癌CSC 的自我更新［34］。靶向Hedgehog 通路的幾種藥物制劑都顯示出可喜的臨床前試驗(yàn)結(jié)果，目前正處于I 期和II 期臨床試驗(yàn)階段。Wnt 信號(hào)通路與維持CSC 的干細(xì)胞特性也有關(guān)。Wnt 信號(hào)通路對(duì)于維持成熟CSC 的自我更新和分化之間的平衡起著至關(guān)重要的作用。各種惡性腫瘤都存在異常的Wnt/βcatenin 信號(hào)，例如白血病、結(jié)腸癌、上皮細(xì)胞癌、乳腺癌和皮膚癌。目前，Wnt 信號(hào)通路的功能在結(jié)腸癌中研究得最深入。結(jié)腸癌是由腺瘤性結(jié)腸息肉病基因缺陷性突變而引起的，該缺陷性突變會(huì)導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白的不恰當(dāng)?shù)姆€(wěn)定化，從而激活Wnt 信號(hào)級(jí)聯(lián)下游各細(xì)胞生長(zhǎng)因子，進(jìn)而誘導(dǎo)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

JAK/STAT 信號(hào)通路也與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。v-Abl是一種較強(qiáng)的非受體酪氨酸激酶，其可以通過(guò)影響JAK/STAT 通路，誘導(dǎo)pre-B 細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。在上游信號(hào)分子v-Abl 的影響下，JAK/STAT 信號(hào)通路已被證明能通過(guò)誘導(dǎo)PIM-1 和PIM-2 激酶，作用于pre-B 細(xì)胞，在pre-B 細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。此外，JAK2-V617F 突變已被證明是促進(jìn)造血細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白家族(suppressor of cytokine signaling，SOCS)能介導(dǎo)JAK/STAT信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控。因此，克服SOCS-1 和SOCS-3 的調(diào)節(jié)作用是激活JAK/STAT 信號(hào)傳導(dǎo)通路并促進(jìn)腫瘤形成的必要因素。有研究［35］已證明JAK/STAT 信號(hào)傳導(dǎo)可由Bcr-Abl 激活，Bcr-Abl 是一種導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病的酪氨酸激酶，能導(dǎo)致SOCS-1 和SOCS-3 的酪氨酸磷酸化，從而削弱這些蛋白抑制JAK/STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活的能力。

PI3K/AKT 信號(hào)通路與多種腫瘤相關(guān)，包括AML和慢性粒細(xì)胞性白血病。AKT 信號(hào)的激活對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成至關(guān)重要。含有E17K 突變的AKT1在v-Abl 介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起著重要的作用，該突變提高了Bcl-2 蛋白水平、加劇了促凋亡蛋白BAD 的磷酸化作用，進(jìn)而增強(qiáng)了抗凋亡作用。此外，PI3K 通路的其他成員(如PTEN 和mTOR)也對(duì)維護(hù)白血病干細(xì)胞的存在發(fā)揮了作用。在包括T 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病、前列腺癌、黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和子宮內(nèi)膜癌等在內(nèi)的多種惡性腫瘤中，PTEN 基因以沉默或缺失的形式發(fā)生了突變。

4.2 靶向關(guān)鍵信號(hào)通路 抑制NF-κB 可大大降低化療耐藥性，靶向NF-κB 的抑制劑可以介導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性。姜黃素是NF-κB 的強(qiáng)效抑制劑，對(duì)NF-κB 相關(guān)通路的抑制作用常常能引起細(xì)胞凋亡反應(yīng)。這一點(diǎn)為進(jìn)一步闡明姜黃素和各種抗腫瘤藥物聯(lián)合運(yùn)用的潛在作用，建立更有效低毒的腫瘤治療方法開(kāi)辟了道路。姜黃素可以通過(guò)抑制MRP 水平、激活細(xì)胞凋亡通路，從而削弱多藥耐藥性。此外，葡萄籽原花青素能通過(guò)下調(diào)NF-κB 活性，阻滯P-gp 的功能和表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)與P-gp 有關(guān)的MDR［36］。沒(méi)食子酸乙酯能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt 通路，抑制其下游靶標(biāo)，如NF-κB 的P-65、Bcl-2/Bax、MMP2和MMP9，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲［37］。

針對(duì)Notch 信號(hào)通路的單克隆抗體展現(xiàn)出誘人的研究前景［38］。如Notch1 基因抑制劑可以顯著降低CD44+CD24－ow亞群的表達(dá)水平，并能降低乳腺癌細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。

肺癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中Wnt 信號(hào)的異常活化與Wnt 的配體、受體、調(diào)節(jié)因子、TCF/LEF 的依賴性轉(zhuǎn)錄都有關(guān)。因此，我們可以從不同途徑，設(shè)計(jì)出多種靶向Wnt 通路的治療策略。由于非小細(xì)胞肺癌中Wnt 信號(hào)通路異?；罨墓餐瑱C(jī)制是啟動(dòng)子甲基化引起Wif-1的沉默，使用脫甲基化劑或重組載體來(lái)恢復(fù)Wif-1 的表達(dá)是一種可行的治療方法。miRNAs-29 家族(miR-29A、29B 和29C)通過(guò)使Wif-1 脫甲基化，抑制Wnt 通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖［39］。

β-catenin 的高表達(dá)與CSC 在結(jié)腸癌中的致瘤性相關(guān)。小分子抑制劑姜黃素通過(guò)強(qiáng)效抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)直接靶向乳腺癌MCF-7 細(xì)胞株CSC，影響CSC 的自我更新功能，抑制CSC 增殖。姜黃素還能通過(guò)抑制Rac1/PAK1 信號(hào)通路、MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲［40］。

將小分子Hedgehog 通路拮抗劑作用于人胰腺癌細(xì)胞原位異種移植小鼠時(shí)，不僅抑制腫瘤的全身性轉(zhuǎn)移，而且還能顯著抑制ALDH 陽(yáng)性細(xì)胞(胰腺癌中的起始腫瘤細(xì)胞群)。環(huán)巴胺是一種SMO 信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，能抑制Hedgehog 通路，并且能夠抑制乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和腦癌在體外和體內(nèi)的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移;環(huán)巴胺還可以與吉西他濱產(chǎn)生協(xié)同作用，減少乙醛脫氫酶高的胰腺癌干細(xì)胞數(shù)量;環(huán)巴胺和替莫唑胺的結(jié)合使用也可降低體內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的腫瘤塊［41］。目前，新合成的包含了Vismodegib(SMO 信號(hào)路抑制劑)和Vorinostat(組蛋白脫乙?；敢种苿?結(jié)構(gòu)元件的嵌合化合物NL-103，能同時(shí)顯著抑制HDAC和Hedgehog 通路，可能成為臨床有效的Hedgehog 通路抑制劑［42］。

5 CSC 凋亡信號(hào)與誘導(dǎo)

5.1 CSC 相關(guān)凋亡信號(hào) 細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的細(xì)胞自主性死亡，又叫細(xì)胞程序性死亡。凋亡過(guò)程實(shí)際上是機(jī)體在不改變組織功能的情況下，將內(nèi)受損細(xì)胞和不需要細(xì)胞快速、無(wú)害、清除的過(guò)程。與壞死相比，細(xì)胞凋亡只在分散的單個(gè)細(xì)胞中發(fā)生，且需要能量才能發(fā)生。凋亡進(jìn)程分為3 個(gè)階段:誘導(dǎo)期、效應(yīng)期和降解期。在誘導(dǎo)期，細(xì)胞接受各種信號(hào)從而引發(fā)各種不同的效應(yīng):進(jìn)入效應(yīng)期后，細(xì)胞經(jīng)受一些決定細(xì)胞命運(yùn)(存活或死亡)的分子調(diào)控點(diǎn)的調(diào)節(jié)，進(jìn)入不可逆的程序化死亡。這些調(diào)控分子包括一系列原癌基因和抑癌基因;降解期則產(chǎn)生可見(jiàn)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡可通過(guò)2 種途徑誘導(dǎo)，分別為外源途徑和內(nèi)源途徑。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)在凋亡中扮演著重要角色。在內(nèi)外源途徑激活下，Caspase 家族引起一系列細(xì)胞變化，如染色質(zhì)凝聚、DNA 斷裂、膜起泡和細(xì)胞皺縮。外源途徑由細(xì)胞外凋亡配體與細(xì)胞表面受體之間的結(jié)合而觸發(fā)。細(xì)胞表面的受體包括死亡受體、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL，或稱Apo2L)受體。內(nèi)源途徑，也稱線粒體途徑，可由多種能觸發(fā)細(xì)胞損傷和DNA 損傷的應(yīng)激信號(hào)激活，這些應(yīng)激信號(hào)包括電離輻射、細(xì)胞毒性劑的作用和生長(zhǎng)因子失活。線粒體的通透性是誘導(dǎo)內(nèi)源性凋亡級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵，其由Bcl-2 家族蛋白介導(dǎo)。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，線粒體釋放凋亡蛋白Smac 到細(xì)胞質(zhì)中，后者與凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)結(jié)合，使其喪失抑制Caspase 活性的作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。所有腫瘤起始細(xì)胞都是通過(guò)逃逸死亡信號(hào)存活下來(lái)的，而且CSC 也是通過(guò)在化、放療中逃逸死亡信號(hào)而最終存活下來(lái)的。由此可見(jiàn)，運(yùn)用細(xì)胞凋亡機(jī)制來(lái)根除腫瘤起始細(xì)胞的治療方法具有巨大的研究潛力。

5.2 CSC 凋亡誘導(dǎo) 腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)通路由眾多的樞紐蛋白調(diào)控，隨著對(duì)CSC 凋亡調(diào)控信號(hào)認(rèn)識(shí)的不斷深入，特異性靶向關(guān)鍵信號(hào)分子的凋亡誘導(dǎo)劑不斷涌現(xiàn)。下面列舉了一些潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物標(biāo)志物及其靶向治療方法。

TRAIL 在細(xì)胞表面與其相應(yīng)的死亡受體結(jié)合可以觸發(fā)外源性凋亡途徑。TRAIL 介導(dǎo)的凋亡是通過(guò)與2種細(xì)胞表面死亡受體TRAIL-R1 和TRAIL-R2 的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。在體外實(shí)驗(yàn)和在多種人類腫瘤的小鼠模型中，TRAIL 能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。目前幾種重組的TRAIL 受體激動(dòng)劑和IAPs 正處于I、Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段［43］。

IAPs 家族(如Survivin、Livin)是一類內(nèi)源性的細(xì)胞抑制因子，其高表達(dá)能抑制細(xì)胞凋亡，且這種抗凋亡作用與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在胰腺癌中，通過(guò)干擾腫瘤細(xì)胞內(nèi)的RNA 靶向XIAP，提高了細(xì)胞凋亡的敏感性，增強(qiáng)了抗轉(zhuǎn)移作用［44］。腫瘤組織中，Survivin 的水平升高和不良預(yù)后關(guān)系密切:細(xì)胞質(zhì)池中高水平Survivin 常顯示預(yù)后不良，但Survivin 在細(xì)胞核池水平高卻提示預(yù)后良好。結(jié)腸癌干細(xì)胞中，Survivin 是由IL-4 信號(hào)通路調(diào)節(jié)的。用STAT6 阻滯劑Leflunomide 阻滯IL-4 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，能升高細(xì)胞核池Survivin 的水平。這可能是因?yàn)镮L-4 的抑制下調(diào)了Survivin 的表達(dá)和改變了其定位，從而使細(xì)胞核池中的Survivin 提高，并以這種方式增加CSC 的化療敏感性［45］。

6 CSC 與腫瘤微環(huán)境

6.1 腫瘤微環(huán)境 體內(nèi)微環(huán)境由不同類型的基質(zhì)細(xì)胞、血管細(xì)胞、炎癥細(xì)胞構(gòu)成。腫瘤與體內(nèi)微環(huán)境之間是相互依賴的。這些腫瘤微環(huán)境里的各類正常細(xì)胞創(chuàng)造了一個(gè)滋養(yǎng)并保護(hù)CSC、防止CSC 在藥物誘導(dǎo)下發(fā)生細(xì)胞凋亡的微型溫床。其不僅對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、維持、侵襲及血管生成起著必不可少的作用，而且深刻影響著腫瘤治療初期反應(yīng)、腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥性的發(fā)展。例如，在B 細(xì)胞惡性腫瘤中，骨髓和次級(jí)淋巴器官的組織微環(huán)境中附帶的基質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)促進(jìn)惡性B 細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和增強(qiáng)其耐藥性，加速腫瘤的進(jìn)展［46］。內(nèi)皮細(xì)胞提供Notch 依賴性腫瘤微環(huán)境，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，增強(qiáng)干細(xì)胞性和轉(zhuǎn)移性［47］;單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞通過(guò)近分泌信號(hào)創(chuàng)造了適宜乳腺癌干細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境［48］。Su 等［49］報(bào)道骨髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的IL-3 可促進(jìn)AML 胚細(xì)胞的增殖并引起凋亡抑制，表明CSC 的存活依賴于其微環(huán)境，靶向CSC 生存所需的微環(huán)境成為腫瘤治療的又一種選擇。

6.2 靶向腫瘤微環(huán)境 由骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1/CXCL12)及其受體CXCR4 之間的相互作用［50］。CXCR4 可以引導(dǎo)白血病細(xì)胞運(yùn)回骨髓微環(huán)境中，骨髓微環(huán)境中分泌CXCL12 確保白血病細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞緊密接觸，從而刺激細(xì)胞生長(zhǎng)并激活化療耐藥性的信號(hào)。CXCR4 拮抗劑，如普樂(lè)沙福和T14003 等，可削弱黏合著的腫瘤－基質(zhì)間的相互作用，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞從骨髓基質(zhì)微環(huán)境中轉(zhuǎn)移出來(lái)，從而增加細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性藥物的敏感性。這種靶向CXCR4-CXCL12 軸治療白血病的新方法正處于臨床試驗(yàn)階段。

腫瘤血管生成也與CSC 生存和耐藥性有關(guān)。血管破壞劑(vascular disruption agents，VDA)能引起腫瘤血管閉塞，使腫瘤細(xì)胞缺氧壞亡，是具有極大潛力的治療方法。BNC105 是一種新型VDA，屬于微管蛋白聚合抑制劑，能使荷瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤逐漸消退，選擇性破壞腫瘤血管并發(fā)揮單藥抗腫瘤作用［51］。此外，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)也與微血管形成和腫瘤生長(zhǎng)存在一定的關(guān)聯(lián)。用Bevacizumab 靶向VEGF 促使腫瘤血管正?；?，可以破壞CSC 的生存小境，抑制腫瘤血管恢復(fù)，已被批準(zhǔn)成為治療腎癌的一線用藥。Bevacizumab 與BNC105聯(lián)合使用能更好發(fā)揮抑制乳腺癌生長(zhǎng)的作用。另外，BNC105 聯(lián)合Everolimus 用于腎癌已經(jīng)進(jìn)入了Ⅱ期臨床隨機(jī)試驗(yàn)階段［52］。

TAT 肽是富含精氨酸的肽，能在體外和體內(nèi)快速輸送小分子藥物到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。將TAT 肽引入中性二氧化硅納米粒子(Mesoporous silica nanoparticles，MSNs)，構(gòu)成了MSNs-TAT 核靶向藥物遞送系統(tǒng)，TAT 肽的引入便利了MSNs-TAT 在核內(nèi)的定位，有利于封裝的阿霉素直接釋放到核漿內(nèi)。通過(guò)該方法將阿霉素直接遞送到多藥耐藥MCF-7/ADR 腫瘤細(xì)胞核內(nèi)，比僅僅依靠二氧化硅納米粒子遞送阿霉素或直接使用阿霉素，能更有效提升細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞核內(nèi)的藥物濃度［53］。

7 結(jié)語(yǔ)

總之，事實(shí)已經(jīng)有力的證明了在各種惡性腫瘤中確實(shí)存在具有自我更新和分化能力的CSC，其對(duì)于腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是至關(guān)重要的。目前，CSC 的鑒定和分離主要基于CSC 的表面標(biāo)志物。不過(guò)，CSC 的表面標(biāo)志物并非在各類腫瘤中普遍存在，隨著新標(biāo)志物的不斷發(fā)現(xiàn)，我們對(duì)CSC 群的認(rèn)識(shí)也在不斷更新。因此，隨著研究的深入，到底需要多少CSC的表面標(biāo)志物才能識(shí)別真正的CSC 群這一問(wèn)題仍有待解決。

近年來(lái)，如何設(shè)計(jì)新穎的方法來(lái)靶向CSC 成為了研究熱點(diǎn)。全面的治療策略可以提高惡性腫瘤療效。比如設(shè)計(jì)出綴合于如下4 個(gè)關(guān)鍵元素的納米顆粒藥物遞送系統(tǒng):1)CSC 分子(配體)的靶向制劑;2)能殺滅CSC 的細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物;3)能克服耐藥性的化療增敏劑(例如ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑);4)加速腫瘤診斷的成像劑。結(jié)合以上這些因素設(shè)計(jì)出的藥物遞送系統(tǒng)不僅可以更有針對(duì)性、強(qiáng)有力發(fā)揮其抗腫瘤效果，而且毒副反應(yīng)較少。CSC 假說(shuō)的興起，拓寬了我們的視野，提供了消滅腫瘤的新方法。然而，如何利用CSC的特異性特征鑒別CSC 仍然有待進(jìn)一步研究。

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