類風(fēng)濕因子對免疫測定干擾的研究進(jìn)展

謝良才，劉天春(綜述)，范 文※，許 蓉(審校)

(長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科，b.骨外科，湖北荊州434000)

類風(fēng)濕因子(rheumatoid factors，RF)是一種臨床常見的自身抗體，常作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的重要診斷指標(biāo)之一［1］，但同樣出現(xiàn)在其他自身免疫性疾?。?-3］、感染性疾?。?-4］，甚至健康人血液中［5］。RF是常見的免疫測定干擾物之一［3］，盡管RF對免疫檢測的干擾發(fā)生率并不高，但RF干擾的潛在性和嚴(yán)重危害性應(yīng)引起實(shí)驗(yàn)室工作人員和臨床醫(yī)師的足夠重視和警覺。目前相關(guān)研究多限于臨床個案的分析和報道，現(xiàn)主要闡述RF對各類不同種類的免疫測定干擾產(chǎn)生的機(jī)制及不同的干擾類型，同時闡述干擾的發(fā)現(xiàn)、鑒別、處理及減少RF干擾發(fā)生的措施，為消除或減少RF對免疫檢測的干擾提供參考。

1 RF對免疫測定的干擾

1.1 RF干擾的檢測項(xiàng)目 RF對許多免疫測定項(xiàng)目存在干擾。內(nèi)分泌類:甲狀腺激素［6］、甲狀旁腺激素［7］;腫瘤標(biāo)志物:糖類抗原 19.9［8］、糖類抗原 125［9］;心肌標(biāo)志物:腦鈉肽［10］、肌鈣蛋白Ⅰ［11］;特異性微生物標(biāo)志物:乙型肝炎表面抗原［12］、丙型肝炎病毒抗體［13］、風(fēng)疹特異性免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M 抗體［14］、結(jié)核分枝桿菌抗體［15］;其他:細(xì)胞因子［16］、C 反應(yīng)蛋白［17］及一些藥物［18］等。

1.2 對雙抗體夾心法免疫檢測的干擾

1.2.1 正干擾(假性增高/假陽性) 雙抗體夾心法用于大部分抗原、蛋白、激素及藥物的檢測。研究證實(shí)，RF對基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附法［12，19］、固相放射免疫［14］、化學(xué)發(fā)光法［10，20-21］、微粒子免疫分析［22］等檢查系統(tǒng)，均存在不同程度的正性干擾。RF對雙抗體夾心法檢測系統(tǒng)干擾的可能機(jī)制為:雙抗體夾心法檢測系統(tǒng)中的捕獲抗體和信號抗體一般均為IgG，當(dāng)樣本中的RF能同時與這兩種抗體Fc段結(jié)合時，便會將捕獲抗體與信號抗體橋接，形成捕獲抗體-RF-信號抗體的復(fù)合物，從而產(chǎn)生非特異性的檢測信號，造成檢測結(jié)果的假性增高或假陽性［16，19］，引起這種干擾的可能是IgM-RF、IgG-RF或者其他型別。

1.2.2 負(fù)干擾(假性降低/假陰性)RF對雙抗體夾心法的免疫分析系統(tǒng)的負(fù)干擾在一些文獻(xiàn)中被提出［23］，但被試驗(yàn)或臨床證實(shí)的報道較少［19，24-25］。RF對免疫測定系統(tǒng)負(fù)干擾的機(jī)制，主要是空間位阻(屏蔽)假說［25］，即當(dāng)RF只能與捕獲或信號抗體中的某一種抗體結(jié)合時，會形成空間位阻(屏蔽)，阻礙捕獲抗體-抗原-信號抗體復(fù)合物的形成，造成檢測信號的減弱或缺失，引起假性降低或假陰性的檢測結(jié)果［24-25］。對于一些三位點(diǎn)免疫檢測法，其干擾發(fā)生的機(jī)制與雙抗體夾心法是相似的。由于同時使用兩種捕獲抗體(或兩種信號抗體)，雖然增加了檢測的敏感性，但同時也增加了干擾發(fā)生率。

1.3 RF對捕獲法檢測IgM類抗體的干擾 捕獲法檢測IgM的干擾目前僅見假性增高的報道［13-14］，是否有假性降低的可能尚有待進(jìn)一步研究。RF對捕獲法干擾有兩種可能的機(jī)制，一種是由IgM-RF引起，由于第一步IgM的捕獲是非特異性的，IgM-RF同樣被捕獲，被捕獲的IgM-RF最后與信號抗體(IgG或IgG的抗原抗體復(fù)合物)結(jié)合，產(chǎn)生檢測信號;另一種機(jī)制則與雙抗體夾心法類似，由RF直接將捕獲抗體和信號抗體橋接，同樣會引起假性增高或假陽性。這兩種機(jī)制由哪一種主導(dǎo)目前尚缺乏相關(guān)研究和報道。

1.4 RF對其他免疫測定的干擾 RF干擾免疫比濁法和乳膠光度免疫分析法也有報道，RF對免疫比濁法干擾機(jī)制主要是發(fā)生在反應(yīng)的第二步，增加抗原抗體復(fù)合物聚集形成多聚體，引起檢測結(jié)果的假性增高［17］。

2 RF對免疫測定系統(tǒng)的干擾特點(diǎn)

2.1 干擾的發(fā)生具有隨機(jī)性 RF對免疫測定系統(tǒng)的干擾是由RF與檢測系統(tǒng)中抗體(主要是IgG)Fc段的非特異性結(jié)合引起的，但這種非特異性的結(jié)合并不是絕對的。某一個體，RF的干擾沒有規(guī)律可循。而其中的原因可能與RF自身的特異性和同系的特異性有關(guān)，一種RF不能與所有的IgG分子Fc部分的抗原結(jié)合，只有當(dāng)RF抗原的決定簇與IgG分子上Fc段對應(yīng)的空間結(jié)構(gòu)有互補(bǔ)性時才有可能結(jié)合，所以RF與IgG Fc段的結(jié)合是隨機(jī)的，沒有結(jié)合規(guī)律可循。因此，某一標(biāo)本中的RF是否能夠引起檢測系統(tǒng)的干擾，事前無法預(yù)料到［26］。

2.2 干擾程度與RF濃度的劑量效應(yīng)不明確 無論高濃度還是低濃度的RF均會對免疫檢測引起干擾。盡管某些研究證實(shí)高濃度的RF較低濃度的RF更易引起干擾，但干擾發(fā)生與RF濃度的量效關(guān)系目前尚不明確［24-26］。一方面是由于RF本身有IgM、IgG、IgA、IgD、IgE等多種成分，干擾是由哪種或哪幾種成分引起，各種成分的干擾效果等均有待進(jìn)一步研究;另一方面是由于RF能夠自身發(fā)生聚集，而形成多聚體;另外，RF可與天然IgG反應(yīng)，但與凝集IgG及免疫復(fù)合物中變性IgG親和力更強(qiáng)［24］。因此，干擾程度可能與分析物濃度也有一定的相關(guān)性(因?yàn)檫@些分析物會與檢測系統(tǒng)抗體形成抗原抗體復(fù)合物)［26］。

3 干擾的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)

3.1 追溯用于檢測干擾抗體的存在 結(jié)果追溯是指當(dāng)化驗(yàn)結(jié)果受到質(zhì)疑(因與臨床結(jié)果不符或超過極端限制的分析結(jié)果)時，在發(fā)出報告結(jié)果之前，依據(jù)完善的機(jī)制或程序，追索確認(rèn)干擾的存在［27］。干擾的可能性應(yīng)始終考慮，即使在管理最好的實(shí)驗(yàn)室，尤其當(dāng)結(jié)果出現(xiàn)與臨床表現(xiàn)不符合時，早期的調(diào)查始終是可取的［28］。追溯方法有明顯的缺點(diǎn)，比如很多檢測結(jié)果本身病理、生理下會出現(xiàn)大的生物學(xué)差異，缺乏充分的臨床資料及臨床表現(xiàn)的復(fù)雜性。因此，利用生理學(xué)上不合理的閾值做判斷，提醒技術(shù)人員所有免疫檢測的潛在干擾是不實(shí)際的。

3.2 積極的用于確認(rèn)干擾抗體存在的方法

3.2.1 樣本連續(xù)稀釋法 通過對分析樣本進(jìn)行連續(xù)稀釋，分析稀釋系數(shù)與濃度梯度改變的線性關(guān)系，是較為簡單、可行的用于干擾發(fā)現(xiàn)和鑒別的方法［10，29］。例如，有報道，利用稀釋法可較好地消除由于異嗜性抗體引起的雅培化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)測定血清人絨毛膜促性腺激素的干擾［30］。

3.2.2 加標(biāo)或加樣回收實(shí)驗(yàn) 加標(biāo)或加樣回收實(shí)驗(yàn)也可鑒定和確認(rèn)干擾的存在與否［29］。通過向檢測樣本中加入已知量的分析物，計算回收率，如果回收率在檢測系統(tǒng)預(yù)定回收率范圍內(nèi)，可排除干擾的存在;如果回收率遠(yuǎn)高于檢測系統(tǒng)正?；厥章?，提示檢測結(jié)果偏高，樣本檢測結(jié)果可能存在假性增高;如果回收率遠(yuǎn)低于檢測系統(tǒng)正?；厥章剩崾緳z測結(jié)果偏低，樣本檢測結(jié)果可能存在假性降低［10］。

3.2.3 使用不同方法學(xué)或不同廠商的檢測系統(tǒng)復(fù)查 使用不同方法學(xué)或不同廠商的檢測系統(tǒng)復(fù)查，尋找與測量的替代方法之間的差異［27，31］。由于RF對檢測系統(tǒng)的干擾是偶然的，不同檢查系統(tǒng)試劑中使用的抗體有一定的差異，因此同一樣本對一種檢測系統(tǒng)有干擾，但對另一檢測系統(tǒng)干擾不一定存在。所以對于一些樣本，尤其是當(dāng)初次檢測結(jié)果與臨床不符時，可采取更換檢測系統(tǒng)的方法復(fù)查樣本，以發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)干擾。

3.3 其他發(fā)現(xiàn)鑒別干擾存在的方法 對于在生理、病理、臨床上有相關(guān)性的項(xiàng)目(如肌酸激酶及其同工酶與肌鈣蛋白、乙型肝炎e抗原與乙型肝炎表面抗原等)，比較相關(guān)檢測項(xiàng)目結(jié)果之間的一致性也是發(fā)現(xiàn)干擾的方法之一。另一種積極的做法是要求提供相關(guān)病史(如風(fēng)濕病史)。實(shí)施這一方法也較為困難，且很可能是無效的，因?yàn)樵谖粗蓴_發(fā)生率、程度及干擾物量效關(guān)系等信息時，很難預(yù)測干擾發(fā)生與否。對所有待檢樣本進(jìn)行盲篩也是不可取的。實(shí)驗(yàn)室和臨床工作人員之間應(yīng)建立良好的溝通，以最大限度地減少因意料之外的干擾而造成錯誤檢測結(jié)果的風(fēng)險。

4 干擾的處理

4.1 樣本前處理 在檢測和分析前對樣本進(jìn)行預(yù)處理以消除或盡可能降低樣本中的RF，以達(dá)到消除或降低RF對檢測系統(tǒng)的干擾。常用的樣本預(yù)處理方法包括:分析前在樣本中加入動物血清或 IgG［7，19］或加入封閉阻斷試劑［32］;用包被IgG 的 固 體 顆 粒 吸 附［10，26］;使 用 阻 斷 試 管 采 集 檢 測 樣本［23，33］;使用聚乙二醇 6000［34］處理樣本，這樣的選擇有一個很好的理由，因?yàn)榕cIgG結(jié)合形成復(fù)合物而干擾免疫檢測的RF主要成分被認(rèn)為是多克隆IgM型RF，而與聚乙二醇6000沉淀的主要是此類較大的復(fù)合物，而對其他小分子單體RF沉淀很少;用蛋白L沉淀［16，35］，但價格較高，使得L蛋白不可能用于臨床試驗(yàn)。盡管這些方法在減少或消除RF干擾方面被證實(shí)是有效的，且其中一些方法也較為簡單實(shí)用，但這些預(yù)處理方法已被證實(shí)并不是對所有RF樣本都有效［19，26，36］。

4.2 改進(jìn)檢測系統(tǒng) 利用抗體工程，在免疫測定中截斷Fc部分(RF的結(jié)合位點(diǎn))，僅保留Fab段的抗體作為檢測試劑，或使用活體的生物素單鏈?zhǔn)且粋€較為理想的解決RF干擾的方法［37-39］。但檢測系統(tǒng)中，無論是捕獲抗體的包被固化，還是信號抗體的標(biāo)記，多在抗體的Fc段，這樣的修改可能增加抗體的包被和標(biāo)記的難度，在工程上依然有一定的困難，因此，目前市場上也無此類檢測系統(tǒng)，但其可能成為今后抗體免疫檢測抗干擾研究的方向之一［37］。也有報道，RF不與卵黃抗體反應(yīng)，如果將捕獲抗體或信號抗體(或兩者)使用卵黃抗體，能夠避免 RF 的干擾［40］。

5 小結(jié)

盡管對RF免疫檢測干擾的研究有了很大的進(jìn)步，并提出很多干擾鑒定和解決的方法，但到目前為止還沒有一種方法可徹底消除RF的干擾。當(dāng)出現(xiàn)與臨床不符的可疑結(jié)果時，檢驗(yàn)人員應(yīng)立即告知實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人，及時與臨床聯(lián)系，尋找干擾原因，運(yùn)用多種檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，力求得出較為準(zhǔn)確的結(jié)果。相信隨著RF相關(guān)干擾的進(jìn)一步研究及免疫檢測技術(shù)、抗體工程技術(shù)的發(fā)展，在不久的將來能徹底解決由此帶來的困擾。

［1］Miller A，Mahtani KR，Waterfeld MA，et al.Is rheumatoid factor useful in primary care?A retrospective cross-sectional study［J］.Clin Rheumatol，2013，32(7):1089-1093.

［2］Newkirk MM.Rheumatoid factors:host resistance or autoimmunity［J］.Clin Immunol，2002，104(1):1-13.

［3］Ingegnoli F，Castelli R，Gualtierotti R.Rheumatoid factors:clinical applications［J］.DIS Markers，2013，35(6):727-734.

［4］Charles ED，Orloff MI，Nishiuchi E，et al.Somatic hypermutations confer rheumatoid factor activity in hepatitis C virus-associated mixed cryoglobulinemia［J］.Arthritis Rheum，2013，65(9):2430-2440.

［5］Tasliyurt T，Kisacik B，Kaya SU，et al.The frequency of antibodies against cyclic citrullinated peptides and rheumatoid factor in healthy population:a field study of rheumatoid arthritis from northern Turkey［J］.Rheumatol Int，2013，33(4):939-942.

［6］Ramos-Leví AM，Montá?ez MC，Ortega I，et al.A case of biochemical assay discrepancy:Interference with measurement of thyroidstimulating hormone due to rheumatoid factor［J］.Endocrinol Nutr，2013，60(6):342-345.

［7］Cavalier E，Carlisi A，Chapelle JP，et al.False positive PTH results:An easy strategy to test and detect analytical interferences in routine practice［J］.Clin Chim Acta，2008，387(1/2):150-152.

［8］Berth M，Bosmans E，Everaert J，et al.Rheumatoid factor interference in the determination of carbohydrate antigen 19-9(CA 19-9)［J］.Clin Chem Lab Med，2006，44(9):1137-1139.

［9］Tsavaris N，Mavragani CP，Pikazis D.Rheumatoid arthritis:correlation between rheumatoid factor levels and CA-125 tumour marker elevation［J］.ANN Rheum DIS，2007，66(7):980.

［10］Fan W，Xu L，Xie L，et al.Negative interference by rheumatoid factor of plasmaB-type natriuretic peptide in chemiluminescentmicroparticle immunoassays［J］.PLoS One，2014，9(8):e105304.

［11］Kenny PR，F(xiàn)inger DR.Falsely elevated cardiac troponin-I in patients with seropositive rheumatoid arthritis［J］.J Rheumatol，2005，32(7):1258-1261.

［12］徐磊，曾耀，胡麗華.類風(fēng)濕因子對ELISA檢測乙型肝炎表面抗原的影響［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，26(5):350-352.

［13］Dlstevenson DL，Harris AG，Neal KR，et al.The presence of rheumatoid factor in sera from anti-HCV positive blood donors interferes with the detection of HCV-specific IgM［J］.J Hepatol，1996，25(5):621-626.

［14］Meurman OH，Ziola BR.IgM-class rheumatoid factor interference in the solid-phase radioimmunoassay of rubella-specific IgM antibodies［J］.J Clin Pathol，1978，31(5):483-487.

［15］Lim KK，Sharif M.Interference by IgM rheumatoid factor on ELISA for antibodies to mycobacterial 65 kDa heat shock protein in rheumatoid arthritis［J］.Br J Rheumatol，1996，35(3):300-301.

［16］Bartels EM，Ribel-Madsen S.Cytokine measurements and possible interference from heterophilic antibodies--problems and solutions experienced with rheumatoid factor［J］.Methods，2013，61(1):18-22.

［17］Ohtake T，Kano S，Watanabe K.Interference in turbidimetric immunoassay for serum C-reactive protein due to serum protein abnormalities an immune complex and rheumatoid factor［J］.Rinsho Byori，2000，48(8):752-759.

［18］Barcelo Martín B，Marquet P，F(xiàn)errer JM，et al.Rheumatoid factor interference in a tacrolimus immunoassay［J］.Ther Drug Monit，2009，31(6):743-745.

［19］Kragstrup TW，Vorup-Jensen T，Deleuran B，et al.A simple set of validation steps identifies and removes false results in a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay caused by anti-animal IgG antibodies in plasma from arthritis patients［J］.Springerplus，2013，2(1):263.

［20］Onuska KD，Hill SA.Effect of rheumatoid factor on cardiac troponin I measurements using two commercial measurement systems［J］.Clin Chem，2000，46(2):307-308.

［21］Yeo KT，Storm CA，Li Y，et al.Performance of the enhanced Abbott AxSYM cardiac troponin I reagent in patients with heterophilic antibodies［J］.Clin Chim Acta，2000，292(1/2):13-23.

［22］Dasgupta A，Banerjee SK，Datta P.False-positive troponin I in the MEIA due to the presence of rheumatoid factors in serum.Elimination of this interference by using a polyclonal antisera against rheumatoid factors［J］.Am J Clin Pathol，1999，112(6):753-756.

［23］Boscato LM，Stuart MC.Incidence and specificity of interference in two-site immunoassays［J］.Clin Chem，1986，32(8):1491-1495.

［24］Xu L，Yu Z，F(xiàn)an W，et al.Negative interference in serum hbsag elisa from rheumatoid factors［J］.PLoS One，2013，8(11):e80620.

［25］Xu L，Wang X，Ma R，et al.False decrease of HBsAg S/CO values in serum with high-concentration rheumatoid factors［J］.Clin Biochem，2013，46(9):799-804.

［26］Todd DJ，Knowlton N，Amato M，et al.Erroneous augmentation of multiplex assay measurements in patients with rheumatoid arthritis due to heterophilic binding by serum rheumatoid factor［J］.Arthritis Rheum，2011，63(4):894-903.

［27］Weber TH，K?pyaho KI，Tanner P.Endogenous interference in immunoassays in clinical chemistry.A review［J］.Scand J Clin Lab Invest Suppl，1990，201:77-82.

［28］Kricka LJ.Interferences in immunoassay-still a threat［J］.Clin Chem，2000，46(8 Pt 1):1037-1038.

［29］Ismail AA.Interference from endogenous antibodies in automated immunoassays:whatlaboratoriansneed to know［J］.J Clin Pathol，2009，62(8):673-678.

［30］Jones GR，Giannopoulos P.A method for routine detection of heterophile antibody interference in the Abbott AxSYM hCG assay［J］.Pathology，2004，36(4):364-366.

［31］Catharine MS，Adie V.Analytical error and interference in immunoassay:minimizing risk［J］.ANN Clin Biochem，2011，48(5):418-432.

［32］Deforge LE，Loyet KM，Delarosa D，et al.Evaluation of heterophilic antibody blocking agents in reducing false positive interference in immunoassays for IL-17AA，IL-17FF，and IL-17AF［J］.J Immunol Methods，2010，362(1/2):71-81.

［33］Emerson JF，Ngo G，Emerson SS.Screening for interference in immunoassays［J］.Clin Chem，2003，49(7):1163-1169.

［34］Bartels EM，F(xiàn)albe WI，Littrup AE，et al.Rheumatoid factor and its interference with cytokine measurements:problems and solutions［J］.Arthritis，2011，2011:741071.

［35］Jager WD，Prakken BJ，Bijlsma JJ，et al.Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies［J］.J Immunol Methods，2005，300(1/2):124-135.

［36］Martins TB，Pasi BM，Litwin CM，et al.Heterophile antibody interference in a multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for quantitation of cytokines in human serum［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2004，11(2):325-329.

［37］Stenman UH.Improving immunoassay performance by antibody engineering［J］.Clin Chem，2005，51(5):801-802.

［38］Johan B，Kjell N，Norum LF，et al.Immunometric assay interferenceincidence and prevention［J］.Clin Chem，2002，48(4):613-621.

［39］Warren DJ，Johan B，Paus E，et al.Use of an in VIVO biotinylated Single-Chain antibody as capture reagent in an immunometric assay to decrease the incidence of interference from heterophilic antibodies［J］.Clin Chem，2005，51(5):830-838.

［40］Greunke K，Braren I，Alpers I，et al.Recombinant IgY for improvement of immunoglobulin-based analytical applications［J］.Clin Biochem，2008，41(14/15):1237-1244.