紅景天苷對局灶性腦缺血大鼠腦組織MAPK信號通路的影響

張小琴，賴文芳，褚克丹，洪桂祝

（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州350122）

紅景天是薔薇目景天科紅景天屬亞灌木或多年生草本植物［1］，主要分布在高山地帶，因其生長環(huán)境惡劣，氣候多變，使其具有極強的環(huán)境適應能力和生命力，有滋補強壯、扶正固本的功效。紅景天苷是紅景天的主要活性成分，近年來對紅景天苷藥理作用方面的研究有了較大的進展。研究表明紅景天苷具有廣泛的藥理作用，除了抗疲勞、抗腫瘤、抗微波輻射、抗衰老的功效，還有抗缺氧、抗肝纖維化、心腦血管系統(tǒng)保護、抗腎損害、增強記憶、增強免疫、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多種藥理作用［2－3］。我們用基因芯片技術，從分子機制上對紅景天苷作用于局灶性腦缺血大鼠腦組織基因表達進行研究，以闡明紅景天苷對局灶性腦缺血大鼠組織MAPK信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物 紅景天苷由福建中醫(yī)藥大學生物醫(yī)藥研發(fā)中心化學合成實驗室提供，純度98%以上。實驗前用超純水配制，按50m g／k g腹腔注射給藥?；蛐酒缮虾？党缮锕こ逃邢薰咎峁?。

1.2 動物 健康成年SD大鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量250～350g，福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（閩）2009－0001。動物分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：每籠5只；溫度：22℃～25℃；相對濕度：40%～70%；飲食：自由進食水和飼料。

1.3 方法 大鼠20只，隨機分為3組：正常組、局灶性腦缺血組（模型組）、紅景天苷給藥組（給藥組）。實驗采用頸內(nèi)動脈線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞（MC AO）模型［4］，大鼠用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術臺上。沿頸部正中切開皮膚，用鑷子鈍性分離皮下組織，分離到氣管前肌后，沿右側(cè)胸鎖乳突肌腱向下分離，可見光滑的頸總動脈，分離出頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈。用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，用眼科剪將頸總動脈剪一小口，插入魚線，插入成功后，結(jié)扎頸內(nèi)動脈，插入深度距動脈分叉約2mm。在傷口處抹上慶大霉素，縫合傷口。將大鼠放入籠中，保溫處理，2h后再灌拔線。給藥后7d斷頭取腦，用刀片完整切出左腦（手術側(cè)），放入預先裝有RNAlater的凍存管中，置于液氮罐凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織mR NA質(zhì)檢和質(zhì)控結(jié)果 取正常組、模型組、給藥組大鼠的左腦，用Trizol法抽提組織R NA，得到R NA樣品濃度、總量和質(zhì)控瓊脂糖電泳圖，見表1、圖1。18S和28S條帶都很清晰，總R NA吸光度值A260／A280＞1.9，表明得到的高純度總R NA，可以用于后期的基因芯片實驗。

表1 9個樣品O D值、濃度、總量和電泳信息

2.2 紅景天苷對局灶性腦缺血大鼠MAPK通路的影響 以紅景天苷大鼠芯片陽性表達基因genesymbol為目錄，輸入京都基因及基因組學數(shù)據(jù)庫（KEGG）得到其蛋白Pathway通路，見圖2。

2.3 紅景天苷對局灶性腦缺血大鼠MAPK通路關鍵基因的影響 以通路中出現(xiàn)的陽性基因為序，找到其對應的基因s y m b l e和注釋，并對其上下調(diào)情況進行統(tǒng)計，見表2。

3 討 論

MAPK信號通路是由一組以級聯(lián)方式依次活化的絲／蘇氨酸蛋白激酶組成，每種MAPK被特異的MAPK激酶（MAPKK，ME K）激活，后者又被MAPKK激酶（MAPKKK，ME KK）激活。MAPK信號通路正是通過這種三級酶促級聯(lián)反應激活其下游轉(zhuǎn)錄因子，以此將細胞外信號逐級放大并傳導到細胞內(nèi)乃至細胞核，把膜受體結(jié)合的胞外刺激物與細胞質(zhì)和細胞核中的效應分子連接起來。MAPK是該信號通路的樞紐，激活的MAPK通過磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子、細胞骨架蛋白及酶類等，參與細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄及凋亡調(diào)節(jié)，并與炎癥、腫瘤及其他多種疾病發(fā)生機制密切相關［5］。本實驗從紅景天苷對MAPK信號通路的基因水平進行闡釋，紅景天苷可能是通過影響了MAPK信號通路的相關基因而產(chǎn)生對局灶性腦缺血大鼠的保護作用，其主要作用靶基因有CACNA1S、CACNB3、CACNG3、DUSP6、FOS、MAPK11、NLK、NR4A1、PRKCB。

表2 紅景天苷對局灶性腦缺血大鼠MAPK通路的關鍵基因的影響

［1］全國中草藥編著組 .全國中草藥匯編：下冊［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：273－274.

［2］崔艷梅，婁安如，趙長琦 .紅景天屬植物化學成分及藥理作用研究進展［J］.北京師范大學學報：自然科學版，2008，44（3）：328－332.

［3］李丹紅，孟玉彩，趙文 .紅景天植物生物活性研究進展［J］.毒理學雜志，2008，22（4）：320－323.

［4］XU X，CHUA C C，GAO J，et al.Neuroprotective effect of humanin on cerebral ischemia／reperfusion in jury is mediated by a PI3K／Aktpathway［J］.Brain Res，2008，1227：12－18.

［5］莫建文，黃河，張春強，等 .絲裂原活化蛋白激酶信號通道對大鼠創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成影響的實驗研究［J］.2007，27（10）：919－921.