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    白花鬼針草乙酸乙酯部位對R KO細(xì)胞線粒體膜電位的影響

    2015-12-08 05:33:56吳建國吳巖斌萬仲賢鄒秀紅吳錦忠
    福建中醫(yī)藥 2015年3期
    關(guān)鍵詞:白花含藥膜電位

    吳建國,吳巖斌,萬仲賢,鄒秀紅,吳錦忠

    (1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院,福建 福州 350122;2.永春縣林業(yè)局,福建 永春 362600)

    白花鬼針草(Bidenspilosavar.radiata Schult.Bip.)為菊科植物白花鬼針草的全草,為泛熱帶性植物,是民間草藥,具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀活血的功效,主要用于治療癰腫瘡癤、感冒發(fā)熱、濕熱黃疸、風(fēng)濕痹痛等[1]。我們前期研究表明白花鬼針草乙酸乙酯部位(E E-B P)含有多個(gè)黃酮類化合物[2],能顯著誘導(dǎo)結(jié)腸癌R KO細(xì)胞的凋亡[3]。線粒體膜電位(△Ψm)的破壞是細(xì)胞凋亡早期發(fā)生的一個(gè)標(biāo)志性事件,細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體膜電位的變化使得膜的通透性發(fā)生改變。膜通透性的增加,使得線粒體蛋白包括細(xì)胞色素C等,從線粒體基質(zhì)釋放到細(xì)胞漿。細(xì)胞色素C的釋放伴隨膜電位的完全喪失,進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡酶的級(jí)聯(lián)效應(yīng)[4]。我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù),以J C-1(5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物)為熒光探針檢測E E-B P對結(jié)腸癌R KO細(xì)胞線粒體膜電位的影響。

    1 材 料

    1.1 藥物和細(xì)胞株 白花鬼針草購自福建省泉州市永春縣藥材市場,經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊成梓副教授鑒定為菊科植物鬼針草屬白花鬼針草Bidenspilosavar.radiata Schult.Bip.的全草,人結(jié)腸癌R KO細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命學(xué)院細(xì)胞資源中心。

    1.2 試劑 石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清(美國Hyclone公司);青霉素-鏈霉素雙抗試劑(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司);細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

    1.3 儀器YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);SW-CJ-1FDA超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);BCD-518WSA冰箱(中國海爾集團(tuán)有限公司);Eppendorf移液器、5417R高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);AnkeTDL-50B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);HF212UVCO2培養(yǎng)箱(香港HealForce公司);D K-420型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);流式細(xì)胞儀(美國B D公司)。

    2 方 法

    2.1 乙酸乙酯部位制備 將干燥的白花鬼針草全草10k g置于多功能提取濃縮機(jī)組提取罐中,加75%的乙醇,浸泡12h,加壓回流提取2次;合并提取液,過濾并減壓濃縮,得到白花鬼針草的乙醇總提取物。總提取物以水混懸后,用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取,乙酸乙酯萃取液經(jīng)過減壓濃縮、干燥后,得乙酸乙酯部位(EE-BP)。

    2.2 含藥培養(yǎng)液的制備取EE-BP以DMSO溶解后,配置成0、25、50、100μg/m L的含藥培養(yǎng)液(含10%FBS、1%雙抗的DMEM 溶液),以0.22μm微孔濾膜過濾除菌后密封,保存于4℃,備用。

    2.3 R KO細(xì)胞線粒體膜電位檢測 R KO細(xì)胞置于含10%F B S的低糖DMEM培養(yǎng)液的6孔板中,37℃、5%C O2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24h后,棄培養(yǎng)液;0、25、50、100μg/m L的含藥培養(yǎng)液,干預(yù)12h后,胰蛋白酶消化后重懸;離心收集5×105細(xì)胞,PBS洗滌2遍;加入500μL的JC-1工作液吹打,將細(xì)胞混懸,并在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育20min,離心,棄上清;加入500μL的Incubation Buffer溶液重新混懸細(xì)胞,于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

    3 結(jié) 果

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、圖1~圖4。

    表1 E E-B P對R KO細(xì)胞線粒體膜電位的影響(±s)

    表1 E E-B P對R KO細(xì)胞線粒體膜電位的影響(±s)

    注:與空白對照組比較,1)P<0.01。

    2550100線粒體膜電位 34.27±0.7410.26±1.551) 22.96±2.871) 29.92±3.451)組 別 n 空白對照組 E E-B P組/(μg/m L)

    4 討 論

    在空白對照組中,△Ψm較高,部分以聚合體的形式存在,紅色熒光強(qiáng)。隨著E E-B P給藥濃度的不斷增加,紅色熒光不斷減弱,△Ψm去極化,J C-1部分以單體的形式存在,發(fā)出綠色熒光,其丟失率隨著給藥的濃度增加而增加,具有顯著性差異,P<0.01,說明E E-B P可以通過降低△Ψm,誘導(dǎo)R KO結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。

    [1]中華本草編委會(huì) .中華本草[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1999:735.

    [2]WU J G,WAN Z X,WU Y B,et al.CHEMICAL CONSTITUENTS OF Bidens pilosavar.radiate[J].Chem Nat Comp,2013,49(4):759-760.

    [3]WU J G,WAN Z X,Y I J,et al.Investigation of the extracts from Bidens pilosa Linn.var.radiata Sch.Bip.for antiox idantactivities and cytotoxicity against human tumor cells[J].JNa t Med,2013,67(1):17-26.

    [4]姚成才,涂遠(yuǎn)榮,姜杰,等 .欖香烯乳誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑逆轉(zhuǎn)肺癌A 549/DDP細(xì)胞株耐藥[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué).2014,22(6):1276-1281.

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