地塞米松預(yù)處理減輕異丙腎上腺素所致心肌損傷及TNF-α的表達(dá)

張嚴(yán)高，余 磊，王建莉，尹戴佳佳，朱閩湘，祝春華，范 潔

Debonera等［1］發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素對肝臟缺血-再灌注具有保護(hù)作用，首次證實(shí)地塞米松(Dexamethasone，DEX)可以通過炎癥信號(hào)通路削弱實(shí)質(zhì)性臟器缺血-再灌注損傷。已有研究證實(shí)削弱炎癥反應(yīng)可減輕急性心肌缺血損傷，DEX等藥物的預(yù)處理在心臟缺血-再灌注損傷、腎臟缺血-再灌注損傷等能有誘導(dǎo)保護(hù)作用［2-3］。本研究觀察DEX預(yù)處理或治療對異丙腎上腺素(isoprotereno，ISO)致小鼠急性心肌缺血損傷影響，并探索相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器 昆明種小鼠16只，雄性，體質(zhì)量20～22g，浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)2007000580817，許可證號(hào)SCXK(滬)2012-0002］。鹽酸異丙腎上腺素注射液(1 mg/2 mL，上海禾豐制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)131003)，地塞米松磷酸鈉注射液(5 mg/1 mL，湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)1408231);7180型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒(北京執(zhí)誠公司，產(chǎn)品批號(hào)ZCAPRN012)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)3102511)、肌酸激酶(CK)試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)403281A)、肌酸激酶同功酶(CK-MB)試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)404213D，以上均為北京利德曼公司產(chǎn)品);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(美國 Ebioscience公司，貨號(hào)BMS607HS)。

1.2 動(dòng)物模型分組與制備 采用腹腔注射ISO建立小鼠急性心肌缺血模型。將16只小鼠隨機(jī)分為正常對照(control，CON)、異丙腎上腺素?fù)p傷(ISO)組、地塞米松預(yù)處理(Dexamethasone pretreatment，DEX-pre)組、地塞米松治療(DEX)組，每組4只。CON組、ISO組首次處理前30 min給予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射預(yù)處理，然后CON組給予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射處理，ISO組小鼠給予ISO(5 mg/kg ISO)腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d;DEX-pre組在首次 ISO注射前30 min給予 DEX(1.25 mg/kg)腹腔注射，余同ISO組;DEX組在第2天、第 3天 ISO注射 30 min后給予 DEX(1.25 mg/kg)腹腔注射，余同ISO組。第4天各組小鼠用10 g/L戊巴比妥鈉(50 g/kg)麻醉，在超凈臺(tái)中進(jìn)行心臟取血后取全心室。

1.3 血清 AST、LDH、CK、CK-MB含量檢測 各組小鼠取血離心分離血清，轉(zhuǎn)置于－20℃低溫冰箱保存待測，采用生化自動(dòng)分析儀進(jìn)行ASL、LDH、CK及CK-MP值檢測，ELISA法檢測血清TNF-α含量。

1.4 心臟組織HE染色 取小鼠心臟后用甲醛固定，石蠟包埋，行心肌間斷連續(xù)切片，切片厚約5 μm，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察各組動(dòng)物心肌病理改變。形態(tài)學(xué)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［4］方法進(jìn)行。0級(jí):心肌細(xì)胞排列緊密，橫紋清晰，心肌纖維染色均勻，核居中，間質(zhì)未見血管擴(kuò)張及炎細(xì)胞浸潤，組織間隙無水腫，無出血壞死，心外膜、心內(nèi)膜無異常計(jì)0分;Ⅰ級(jí):心肌細(xì)胞排列稀疏，間質(zhì)血管擴(kuò)張及少量炎細(xì)胞浸潤，肌漿分布不勻，心肌間質(zhì)水腫，無出血，可見心肌散在的點(diǎn)狀壞死，主要為凝固性壞死灶，局限在心內(nèi)膜下，計(jì)2分;Ⅱ級(jí):部分心肌壞死灶呈片狀分布，灶間無連接，病變累及心壁全層，間質(zhì)可見血管擴(kuò)張及炎細(xì)胞浸潤，有灶性出血，心肌間質(zhì)有炎性出血及心肌間質(zhì)水腫，計(jì)4分;Ⅲ級(jí):心肌廣泛性大片壞死，灶間相互連接累及心壁全層，有明顯的間質(zhì)血管擴(kuò)張、水腫、出血及炎細(xì)胞浸潤，計(jì)6分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清 ASL、LDH、CK、CK-MP含量檢測 與CON組比較，ISO組ASL、LDH、CK均明顯升高(P＜0.01)，CK-MP無明顯改變(P＞0.05);與ISO組比較，DEX-pre組ASL、CK下降非常顯著(P＜0.01)，LDH、CK-MP輕度下降(P＜0.05);與ISO組比較，DEX組ASL、LDH、CK、CK-MP均無明顯改變(P＞0.05，表1)。

2.2 心肌組織的病理學(xué)改變 光鏡下觀察各組動(dòng)物心肌病理顯示，CON組心肌細(xì)胞排列整齊、致密，胞質(zhì)著色均勻，胞核清晰，間質(zhì)細(xì)胞無增生，未見炎性滲出、無水腫(圖1①)。ISO組心肌細(xì)胞體積增大呈圓形或類圓形，排列紊亂，細(xì)胞核固縮深染，血管和心肌細(xì)胞之間可見纖維增多、炎性細(xì)胞浸潤、少許淋巴細(xì)胞浸潤，少量紅細(xì)胞外滲，多處見局灶性壞死，肌溶解、核消失或不著色(圖1②)。DEX-pre組心肌損害較ISO組明顯減輕，可見殘存正常肌纖維明顯增多，核圓形、有核仁，胞漿深紅色，局灶性壞死明顯減少散在的點(diǎn)狀，肌纖維排列紊亂改善，血管和心肌細(xì)胞之間未見纖維增多、炎性細(xì)胞浸潤、淋巴細(xì)胞浸潤(圖1③)。DEX組肌纖維間充血水腫明顯，可見殘存少許正常肌纖維;多處見肌溶解、核消失或不著色的局灶性壞死，炎性細(xì)胞浸潤不明顯(圖1④)。與CON組比較，ISO組心肌損傷明顯加重，形態(tài)學(xué)計(jì)分為4.0比0.0(P＜0.01);與ISO組比較，DEX-pre組心肌損傷得到明顯改善，形態(tài)學(xué)計(jì)分為2.0比4.0(P＜0.01)，DEX 組心肌損傷無明顯變化，形態(tài)學(xué)計(jì)分為 3.5 比4.0。

表1 各組ASL、LDH、CK、CK-MP水平(±s)

表1 各組ASL、LDH、CK、CK-MP水平(±s)

注:與 CON 組比較，＊＊P＜0.01;與 ISO組比較，▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01

組別 n ASL(U/L) LDH(U/L) CK(U/L) CK-MP(U/L)CON組4 4 156 ±9.8 436 ±18.9 671 ±30.2 214 ±18.2 83 ±5.2 309 ±12.6 452 ±22.4 195 ±16.2 ISO 組 4 170 ±12.8＊＊ 451±21.6＊＊ 692±28.6＊＊ 215±18.2 DEX-pre組 4 87±6.1▲▲ 385±14.3▲ 329±24.3▲▲ 187±13.6▲DEX組

圖1 光鏡下各組心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE染色 上×200，下×400)

2.3 血清TNF-α含量檢測 ISO組TNF-α明顯升高［ISO 組、CON 組分別為(2.346±0.423)pg/mL、1.578 ±0.205)pg/mL，P ＜0.05)］;DEX-pre組與ISO組比較，TNF-α下降非常顯著［分別為(0.415±0.089)pg/mL、(2.346 ± 0.423)pg/mL，P ＜ 0.01］;DEX組與ISO組比較，TNF-α升高非常顯著［分別為(18.728 ±2.803)pg/mL、(2.346 ±0.423)pg/mL，P＜0.01］;DEX-pre組TNF-α明顯低于CON組［分別為(0.415 ± 0.089)pg/mL、(1.578 ± 0.205)pg/mL，P ＜0.01］。

3 討論

采用皮下注射或腹腔注射ISO可導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血缺氧損傷，是常用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性急性心肌缺血模型。目前認(rèn)為ISO誘導(dǎo)的心肌損傷與心肌相對缺血缺氧、膜通透性改變、氧自由基損傷等有關(guān)［5］。連續(xù)注射ISO使心肌中氧化應(yīng)激劇增導(dǎo)致氧自由基聚集，細(xì)胞膜通透性增高，肌漿內(nèi)的可溶性酶大量釋放進(jìn)入血液中，導(dǎo)致血清心肌酶(ASL、LDH、CPK)的水平顯著升高。AST、CK、LDH的活力及心肌病理學(xué)改變是評價(jià)心肌細(xì)胞損害程度的重要指標(biāo)［6］。本研究中ISO造成心肌細(xì)胞損傷后ASL、LDH、CK的水平顯著升高，心肌局灶性壞死明顯，與以往研究相符［4，6］，說明本文小鼠心肌缺血模型造模成功。TNF-α是重要的前炎性細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中有重要的作用。臨床研究提示，冠心病患者血清TNF-α水平明顯高于正常人，并隨病情的加重而升高，TNF-α在急性心梗發(fā)病早期即可明顯升高，檢測TNF-α對急性心梗發(fā)病早期診斷具有重要意義［7-9］，TNF-α水平的升高亦與心肌功能抑制有明顯的相關(guān)性［10］。本研究證實(shí)ISO造成心肌細(xì)損傷后TNF-α明顯升高(P＜0.05)，TNF-α與急性心肌缺氧損傷有一定相關(guān)性。

TNF-α可通過腫瘤壞死因子受體參與信號(hào)傳遞和T細(xì)胞增殖，而腫瘤壞死因子受體對TNF也具有動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)作用［11］;核轉(zhuǎn)錄因子-kB抑制劑可通過干擾TNF-α的基因轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致其分泌的蛋白量降低，發(fā)揮有益效應(yīng)［12］，以往研究證實(shí) DEX預(yù)處理可減輕缺血再灌注后心肌損傷并起保護(hù)作用［13-14］。糖皮質(zhì)激素通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、發(fā)育、自身穩(wěn)定和細(xì)胞凋亡來維持機(jī)體組織細(xì)胞的平衡及其功能，而且糖皮質(zhì)激素具有抗炎等作用。本研究以糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)激動(dòng)藥DEX通過干擾TNF-α合成，對急性心肌缺氧損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。研究結(jié)果顯示經(jīng)DEX預(yù)處理，ISO導(dǎo)致的ASL和CK升高得到明顯抑制(P＜0.01)，ISO導(dǎo)致的TNF-α升高亦得到明顯抑制(P＜0.01)，心肌損害明顯減輕，表明DEX預(yù)處理對小鼠心肌缺血缺氧有一定的保護(hù)作用，與以往DEX對小鼠心肌缺血-再灌注損傷、腎缺血-再灌注損傷、腦出血大鼠腦水腫引起 TNF-α 水平的改變的報(bào)道相符［3，15］。而 ISO 導(dǎo)致小鼠心肌損傷后給予DEX治療卻沒有相似的保護(hù)作用，在ISO導(dǎo)致?lián)p傷后給予DEX治療后TNF-α反而明顯升高(P＜0.01)。因此，本文認(rèn)為DEX預(yù)處理對ISO所致小鼠心肌缺血具一定的保護(hù)作用，其中TNF-α水平的改變發(fā)揮重要的作用，但以DEX治療并無明顯得益?？赡蹹EX預(yù)處理可顯著減少炎癥因子TNF-α的表達(dá)，使ISO導(dǎo)致心肌炎性損傷控制在一定的水平，從而減輕心肌缺血損傷;DEX預(yù)處理還可通過發(fā)揮抗凋亡等多途徑作用，而減輕心肌缺血損傷，而以DEX治療使TNF-α明顯升高可能抵消DEX預(yù)處理誘導(dǎo)的其他有益作用。在ISO所致急性心肌細(xì)胞缺血缺氧損傷中，DEX預(yù)處理誘導(dǎo)產(chǎn)生的早期保護(hù)作用和延遲保護(hù)作用，尤其后者保護(hù)時(shí)間長更具潛在的實(shí)用價(jià)值，使機(jī)體較長時(shí)間處于一種保護(hù)狀態(tài)。這種保護(hù)作用，可能在不穩(wěn)定性冠心病，尤其是急性心肌梗死超早期產(chǎn)生的類似效應(yīng)，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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