亞最低殺菌濃度阿莫西林對(duì)體外誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的耐藥研究

陳榮劍，祝仲珍，王占科，楊莉萍，袁小蘭，胡新華，寧麗萍，蘭小鵬

臨床抗菌藥物的不合理使用促進(jìn)和誘導(dǎo)了細(xì)菌耐藥的發(fā)生，研究導(dǎo)致細(xì)菌耐藥原因和機(jī)理已引起國(guó)內(nèi)外高度重視［1-3］?？咕幬锸褂貌缓侠恚咕幬锸褂梅N類不合理和抗菌藥物使用劑量不合理。有文獻(xiàn)報(bào)道，低劑量抗菌藥物可體外誘導(dǎo)臨床患者感染菌株發(fā)生細(xì)菌耐藥現(xiàn)象［4］，但低劑量抗菌藥物濃度體外誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)菌株耐藥性的研究報(bào)道，國(guó)內(nèi)外不多。金黃色葡萄球菌是臨床住院感染患者的常見(jiàn)致病菌，也是醫(yī)院內(nèi)感染的常見(jiàn)菌，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)青霉素敏感，但臨床患者感染的金黃色葡萄球菌菌株普遍存在耐藥現(xiàn)象［5-6］。為此，本文以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為研究對(duì)象，通過(guò)阿莫西林亞最低殺菌濃度(Sub-minimum bactericidal concentration，Sub-MBC)體外多步誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株MBC值變化，旨在證明亞最低殺菌濃度抗菌藥物可誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥的發(fā)生，為臨床合理使用抗菌藥物劑量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29213，由江西省臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.1.2 抗菌藥物 阿莫西林，規(guī)格為0.5 g/支，批號(hào)為20140120，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 主要試劑和設(shè)備 M-H肉湯細(xì)菌培養(yǎng)液(批號(hào)為20140318)及M-H瓊脂固體培養(yǎng)平板(直徑9 cm，批號(hào)為20131124B)購(gòu)自鄭州安圖綠科生物工程有限公司;系列麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管，購(gòu)自梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;LRHS-100型37℃恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公;BSC1500RIB2X型生物安全柜，購(gòu)自濟(jì)南博科生物技術(shù)有限公司。WALK AWAY 40SI型全自動(dòng)藥敏鑒定分析儀及藥敏板條，購(gòu)自上海西門(mén)子醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株液制備 在生物安全柜中，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株解凍后，無(wú)菌操作條件下，將標(biāo)準(zhǔn)菌株接種在M-H瓊脂固體培養(yǎng)平板復(fù)活，然后接種于不含抗菌藥物的M-H肉湯培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)24 h后，用麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管調(diào)整菌液濃度為1×105CFU/mL備用。

1.3.2 微量稀釋法測(cè)定MBC 用抗菌藥物微量稀釋法測(cè)定金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株MBC。參考文獻(xiàn)［7］，首先用M-H細(xì)菌培養(yǎng)液對(duì)阿莫西林進(jìn)行倍比稀釋，分別加入12×8孔聚苯乙烯無(wú)菌微孔培養(yǎng)板中，然后再分別加入金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)原始菌株或誘導(dǎo)菌株，使抗菌藥物終濃度分別為1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 和 0.5 μg/mL，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)原始菌株或誘導(dǎo)后菌株終濃度為1×105CFU/mL。同時(shí)，設(shè)空白對(duì)照孔和生長(zhǎng)對(duì)照孔，空白對(duì)照孔加M-H細(xì)菌培養(yǎng)液，但不加細(xì)菌液;生長(zhǎng)對(duì)照孔加細(xì)菌液和M-H細(xì)菌培養(yǎng)液，但不加抗菌藥物。微孔細(xì)菌培養(yǎng)板37℃培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察微孔內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)情況，取清晰透明底部無(wú)沉淀微孔細(xì)菌培養(yǎng)液，三線法接種在M-H瓊脂固體培養(yǎng)基，24 h培養(yǎng)后觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。M-H瓊脂固體培養(yǎng)基上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最小抗菌藥物濃度為MBC。為減少M(fèi)BC測(cè)定實(shí)驗(yàn)誤差以及確保Sub-MBC藥物濃度誘導(dǎo)，避免誤使用MBC藥物濃度導(dǎo)致細(xì)菌全部殺死造成誘導(dǎo)終止和失敗，本實(shí)驗(yàn)同一菌株平行測(cè)定5次，MBC值均發(fā)生變化，才被認(rèn)定誘導(dǎo)后菌株MBC變化值。

1.3.3 Sub-MBC抗菌藥物多步誘導(dǎo)耐藥菌株 首先用微量稀釋法測(cè)定抗菌藥物最低殺菌濃度，測(cè)定金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)原始菌株 MBC值，記為MBC0。取10 μL金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)原始菌株(MBC0)加入5.0 mL M-H液態(tài)培養(yǎng)基中，調(diào)整阿莫西林終濃度為1/2 MBC0(亞最低殺菌濃度)，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，測(cè)定誘導(dǎo)后菌株MBC值，如果MBC值沒(méi)有變化，保持抗菌藥物濃度不變，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)菌，每天均測(cè)定MBC值，并觀察有無(wú)變化。如果經(jīng)多次誘導(dǎo)培養(yǎng)后菌株 MBC值發(fā)生變化，記作MBC1，改變抗菌藥物終濃度為1/2 MBC1，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，繼續(xù)每天測(cè)定MBC值。如果多次誘導(dǎo)培養(yǎng)后，菌株MBC值又發(fā)生變化，再記作MBC2，改變抗菌藥物終濃度為1/2 MBC2，再繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。以此類推，連續(xù)誘導(dǎo)30 d，每天測(cè)定并記錄MBC變化值及其誘導(dǎo)變化時(shí)間(圖1)。

圖1 亞最低殺菌濃度抗菌藥物多步誘導(dǎo)耐藥菌株

1.3.4 誘導(dǎo)后耐藥菌株的鑒定 本組實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)出的耐藥菌株(MBC升高10倍以上)，經(jīng)不含任何抗菌藥物M-H液態(tài)增菌培養(yǎng)基，穩(wěn)定傳代3次，用麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管調(diào)整菌液濃度為1×105CFU/mL(0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?，經(jīng)WALK AWAY 40SI型全自動(dòng)西門(mén)子藥敏鑒定分析儀，自動(dòng)判斷對(duì)阿莫西林的耐藥性，重復(fù)測(cè)定10次，并與誘導(dǎo)前標(biāo)準(zhǔn)菌株耐藥性進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用百分率(%)表示;金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)原始菌株和不同誘導(dǎo)時(shí)間后菌株MBC值進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)原始菌株和誘導(dǎo)成功后菌株的阿莫西林耐藥百分率進(jìn)行χ2分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sub-MBC阿莫西林不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌MBC值影響 金黃色葡萄球菌ATCC 29213標(biāo)準(zhǔn)菌株阿莫西林MBC值為4.0 μg/mL，通過(guò)1/2 MBC阿莫西林濃度誘導(dǎo)，并根據(jù)菌株MBC值升高不斷調(diào)整提高誘導(dǎo)濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后7、14、20、25和30 d菌株MBC分別升高到誘導(dǎo)前的2、4、8、16和32倍。誘導(dǎo)后25 d和30 d金黃色葡萄球菌阿莫西林MBC值分別升高到64 μg/mL和128 μg/mL(表1和圖2)。

表1 亞最低殺菌濃度阿莫西林不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌MBC值影響

圖2 亞最低殺菌濃度阿莫西林不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌MBC值影響

2.2 誘導(dǎo)出的耐藥菌株對(duì)阿莫西林耐藥性鑒定本組實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)出的金黃色葡萄球菌耐藥菌株，經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌藥敏鑒定分析儀進(jìn)行藥敏鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)阿莫西林耐藥率為100%，而原始菌并不耐藥，標(biāo)準(zhǔn)菌株體外耐藥誘導(dǎo)成功。

3 討論

臨床患者感染的細(xì)菌發(fā)生耐藥問(wèn)題，已引起臨床高度重視［8］。研究細(xì)菌耐藥機(jī)理，探討細(xì)菌耐藥發(fā)生原因，為防治細(xì)菌發(fā)生耐藥具有重要意義。標(biāo)準(zhǔn)菌株是指遺傳信息和生物學(xué)性狀明確的商品化的菌株，常用于做細(xì)菌耐藥性試驗(yàn)的質(zhì)控菌株［9］。文獻(xiàn)報(bào)道，金黃色葡萄球菌ATCC 29213質(zhì)控菌株阿莫西林的肉湯稀釋法最低抑菌濃度(MIC)值為0.12 ～0.5 μg/mL［10］。本實(shí)驗(yàn)采用微量倍比稀釋法檢測(cè)的金黃色葡萄球菌ATCC 29213標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株MBC 值為 4.0 μg/mL，最低抑菌濃度(minimum Inhibitory concentration，MIC)值為 2.0 μg/mL，提示對(duì)阿莫西林藥物敏感，其MIC值略高于文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)值，可能和本實(shí)驗(yàn)的條件和文獻(xiàn)存在差異有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，采用1/2MBC值的阿莫西林亞藥物濃度誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌ATCC 29213標(biāo)準(zhǔn)菌株7 d，MBC值開(kāi)始明顯升高1倍，然后再提高阿莫西林誘導(dǎo)濃度，再誘導(dǎo)7 d，MBC又升高1倍。隨著誘導(dǎo)菌MBC值不斷升高，我們不斷提高阿莫西林誘導(dǎo)藥物濃度，分別在第20天、第25天和第30天MBC值發(fā)生顯著變化，誘導(dǎo)第30天MBC值升高了32倍，發(fā)生變化誘導(dǎo)間隔由開(kāi)始的7 d縮短為5 d，提示隨著亞最低殺菌濃度抗菌藥物的使用延長(zhǎng)，誘導(dǎo)耐藥菌產(chǎn)生的速度明顯加快。金黃色葡萄球菌ATCC 29213標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)過(guò)5次MBC升高，歷經(jīng)30 d最終變成耐藥菌株，并得到全自動(dòng)藥敏鑒定分析儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果的證實(shí)，提示使用亞最低殺菌濃度阿莫西林可以體外誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，為臨床正確使用大于MBC值抗菌藥物劑量，預(yù)防細(xì)菌耐藥發(fā)生，提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

在抗菌藥物臨床應(yīng)用中，抗菌藥物突變選擇窗(mutation selection window，WSW)可作為指導(dǎo)臨床選擇抗菌藥物治療劑量的重要依據(jù)［11］，WSW一般大于MIC且小于耐藥變異預(yù)防濃度(mutation prevention concentration，MPC)，但 MPC是臨床患者的調(diào)查結(jié)果，和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的細(xì)菌體外MBC在數(shù)值上并不完全相同。值得注意的是，臨床上細(xì)菌出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，并不是突然發(fā)生的，細(xì)菌從敏感到耐藥，有一個(gè)漸變的過(guò)程，表現(xiàn)為MBC或MIC值逐步發(fā)生變化，而WSW在理論上也是在變化中，因此本研究每天都要對(duì)誘導(dǎo)菌進(jìn)行MBC值檢測(cè)并不斷調(diào)整誘導(dǎo)濃度。

Sub-MBC阿莫西林抗菌藥物濃度對(duì)體外誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌敏感菌株發(fā)生耐藥，可能因同一菌株在繁殖過(guò)程中存在藥物耐藥性差異;其次，亞最低殺菌濃度殺死絕大多數(shù)藥物敏感細(xì)菌后，留下對(duì)藥物耐藥的極少部分“逃逸細(xì)菌”株;而“逃逸細(xì)菌”株藥物耐藥出現(xiàn)遺傳學(xué)改變可被穩(wěn)定傳代。阿莫西林是青霉素類抗菌藥物，其化學(xué)分子中的內(nèi)酰胺基可快速與金黃色葡萄球菌體內(nèi)某種轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)肽酶失活，細(xì)菌無(wú)法合成細(xì)胞壁而受到破壞。已有文獻(xiàn)報(bào)道，亞抑菌濃度抗菌藥物可通過(guò)體外誘導(dǎo)細(xì)菌生物膜形成，并通過(guò)SOS基因損傷修復(fù)機(jī)制導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的發(fā)生［12-13］。本研究提示，臨床長(zhǎng)時(shí)間以低于MBC值劑量使用抗菌藥物可誘導(dǎo)耐藥菌株即“逃逸細(xì)菌”的產(chǎn)生，臨床用藥不僅要合理使用抗菌藥物種類，更要重視和合理使用抗菌藥物的使用劑量。

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