干蓮子及其磨皮粉中蛋白質(zhì)的組成特性比較

王發(fā)祥，賀 偉，李 微，俞 健，李向紅，王建輝，劉永樂

（長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 41 0114）

干蓮子及其磨皮粉中蛋白質(zhì)的組成特性比較

王發(fā)祥，賀 偉，李 微，俞 健，李向紅，王建輝，劉永樂*

（長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 41 0114）

以凱氏定氮法、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）和體積排阻高效液相色譜（size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）法對比了干蓮子與其磨皮粉中蛋白質(zhì)含量及其亞基組成和分子質(zhì)量分布。結(jié)果表明：干蓮子與其磨皮粉蛋白含量分別為188.10、186.54 mg/g；二者水溶性、鹽溶性蛋白質(zhì)組分含量均超過總蛋白的60%，酸溶性、堿溶性蛋白質(zhì)組分含量均不足總蛋白的23%。干蓮子與其磨皮粉蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖譜幾乎一致，含量較多的蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量主要集中在15～20 kD和30～50 kD；蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布也高度相似，各組分的HPLC洗脫峰基本一致，但蓮子蛋白質(zhì)中酸溶性蛋白的種類較多、堿溶性蛋白的含量較大。本研究表明蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)的組成特性與蓮子蛋白質(zhì)基本一致，可以替代蓮子用于生產(chǎn)蓮子蛋白粉或其他含蓮蛋白食品。

蓮子；蓮子磨皮粉；副產(chǎn)物；蛋白質(zhì)；組成；比較

蓮為多年水生草本植物，是我國特有植物，2012年全國種植面積達(dá)150萬 畝以上。蓮子為蓮的成熟種子，自古以來就是公認(rèn)的老少皆宜的鮮美滋補(bǔ)佳品，除具有鎮(zhèn)靜、強(qiáng)心、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤等作用外，還是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的食物，含有豐富的糖類、蛋白質(zhì)、維生素及鈣、鐵、磷等多種人體所必需的礦質(zhì)元素[1-5]。干蓮子蛋白質(zhì)含量平均為17.3%，其氨基酸組成種類齊全，必需氨基酸含量占氨基酸總量的27.8%；每100 g干蓮子中含鈣89 mg，含磷285 mg，含鉀量在所有動(dòng)、植物食品中位居榜首[6-7]。因此，蓮子的各類加工產(chǎn)品深受消費(fèi)者喜愛，具有廣闊的市場前景，而蓮子的加工率和加工水平也在逐年提高。

蓮子表層有一層紅色的種皮，會(huì)影響蓮子產(chǎn)品的外觀和口味，目前主要使用機(jī)械磨皮的方式脫除。機(jī)械磨皮過程中會(huì)產(chǎn)生占蓮子總質(zhì)量20%左右的磨皮粉，按全國蓮子年產(chǎn)量40萬 t計(jì)算，每年約產(chǎn)生蓮子磨皮粉8萬 t。研究表明，蓮子磨皮粉中含有豐富的營養(yǎng)成分，除含有較多的粗蛋白、粗脂肪、碳水化合物、灰分和粗纖維外，此外還含有酚類、鞣質(zhì)、皂苷、蒽醌、黃酮和生物堿等成分[8]。然而，目前相關(guān)蓮子加工企業(yè)對蓮子磨皮粉沒有充分利用，主要用于生產(chǎn)飼料，有的甚至直接扔掉，造成了極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。因此研究蓮子磨皮粉的綜合利用，對于提高蓮子產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，保護(hù)環(huán)境和資源的充分利用都有著重要的實(shí)際意義。

一直以來，國內(nèi)外關(guān)于蓮子蛋白質(zhì)的研究較多[9-11]，但現(xiàn)有對蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)的研究報(bào)道，近年來，已有研究者開始關(guān)注蓮子磨皮粉的綜合利用問題，開展了蓮子皮中蛋白質(zhì)、原花青素、果膠多糖等的提取工藝優(yōu)化等研究[6,12-14]，但還停留在初步研究水平，尚需進(jìn)一步深入。本研究比較了蓮子與其磨皮粉中總蛋白質(zhì)及不同溶解性蛋白組分的含量、亞基組成、分子質(zhì)量分布等組成特性，為蓮子磨皮粉替代蓮子用于生產(chǎn)蓮子蛋白粉或其他含蓮蛋白食品，實(shí)現(xiàn)物盡其用提供理論依據(jù)，也對蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)的有效利用具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干蓮子為市售普通紅皮圓粒湘蓮，磨皮粉為其機(jī)械磨皮的副產(chǎn)物，均由湖南粒粒珍湘蓮有限公司提供。

標(biāo)準(zhǔn)品甲狀腺球蛋白、醛縮酶A、牛血清白蛋白、卵清白蛋白、辣根過氧化物酶、腺苷酸激酶、肌紅蛋白、核糖核酸酶、抑肽酶、VB12美國Sigma公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美國Amresco公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY-10A多功能粉碎機(jī) 浩瀚工貿(mào)有限公司；LC20高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 蓮子粉及其磨皮粉制備

稱取適量（約250 g）干蓮子于多功能粉碎機(jī)中磨粉5 min，取出過100 目篩備用，即為蓮子粉；同樣的方法處理蓮子磨皮粉備用，即為磨皮粉樣品。

1.3.2 蓮子磨皮粉基本成分分析

蛋白質(zhì)含量測定參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》測定；淀粉含量測定參考GB/T 5009.9—2003《食品中淀粉的測定》；粗脂肪含量測定參考GB/T 5009.7—2003《食品中還原糖的測定》；水分含量測定參考GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》。

1.3.3 總蛋白質(zhì)樣品及其不同溶解性組分樣品制備及蛋白質(zhì)含量測定

參考劉永樂等[10]最優(yōu)條件提取蓮子粉和磨皮粉的蛋白質(zhì)，即為蓮子和磨皮粉總蛋白質(zhì)樣品。

精確稱取約2 g蓮子粉或磨皮粉樣品（精確至0.01 g）于50 mL的離心管中，加入18 mL蒸餾水，均質(zhì)0.5 min，25 ℃條件下浸提30 min，8 000 r/min離心10 min，沉淀再以9 mL蒸餾水提取1 次，合并兩次上清液，即為水溶性蛋白提取液。所得沉淀依次按上述方法分別用鹽溶液（0.5 mol/L NaCl溶液）、酸溶液（pH 2.0 HCl溶液）、堿溶液（pH 12.0 NaOH溶液）浸提，即得鹽溶性蛋白提取液、酸溶性蛋白提取液、堿溶性蛋白提取液。

各蛋白提取液以凱氏定氮法測定其蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）分析

分別準(zhǔn)確吸取各種蛋白質(zhì)樣品200 μL于1.5 mL Eppendorf管中，加入等體積的2×上樣緩沖液，沸水浴5 min，10 000 r/min離心3 min，所得上清液即為電泳樣品。參考李強(qiáng)等[15]的方法以12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3.5 體積排阻高效液相色譜（size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）分析

各種蛋白質(zhì)樣品以0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）（含2% SDS，pH 7.0）稀釋10 倍，室溫下用磁力攪拌器攪拌10 min，10 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。參考Liu Yongle等[16]的方法，不同蛋白質(zhì)樣品以進(jìn)行SEC-HPLC分析，上樣量為20 μL，檢測波長220 nm；色譜條件為：Shodex KW-804蛋白柱（8.0 mm×300 mm），紫外檢測器，柱溫為25 ℃，流動(dòng)相為0.2 mol/L的PBS緩沖液（含2% SDS，pH 7.0），洗脫速率為1 mL/min。

同時(shí)以甲狀腺球蛋白（669 kD）、醛縮酶A（158 kD）、牛血清白蛋白（67 kD）、卵清白蛋白（43 kD）、辣根過氧化物酶（40.2 kD）、腺苷酸激酶（32 kD） 、肌紅蛋白（17 kD）、核糖核酸酶（13.7 kD）、抑肽酶（6.5 kD）和VB12（1.35 kD）為標(biāo)準(zhǔn)品，同樣條件下進(jìn)行SECHPLC分析，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，分子質(zhì)量對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=0.570 6x+ 10.596（R2=0.950 1）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線估算樣品中蛋白質(zhì)峰的分子質(zhì)量大小[17]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮子磨皮粉中基本營養(yǎng)成分分析

表1 蓮子磨皮粉中的主要營養(yǎng)成分含量Table 1 Major nutritional constituents of peel waste from lotus seed

由表1可知，蓮子磨皮粉中蛋白含量為18.65%，淀粉含量為40.69%，脂肪含量為1.87%，其他成分為如粗纖維、果膠、灰分等含量為27.56%，可見蓮子磨皮粉中含有豐富的蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分。

2.2 干蓮子及其磨皮粉中蛋白質(zhì)含量比較

圖1 蓮子及其磨皮粉蛋白含量分析Fig.1 Total protein contents in lotus seeds and its peel waste

由圖1可知，干蓮子的總蛋白質(zhì)含量為188.10 mg/g，蓮子磨皮粉的總蛋白質(zhì)含量為186.54 mg/g，二者無顯著性差異。

2.3 干蓮子與其磨皮粉中蛋白質(zhì)組分比較

根據(jù)可溶性蛋白質(zhì)的溶解性，可將其分為水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、酸溶性蛋白、堿溶性蛋白和醇溶性蛋白5 組，其中水溶性蛋白主要為清蛋白，鹽溶性蛋白主要為球蛋白，酸溶和堿溶性蛋白主要為谷蛋白。由于干蓮子中醇溶性蛋白含量不足0.4%[18]，本研究主要對比干蓮子與其磨皮粉中其余4 組蛋白質(zhì)組分的含量，結(jié)果如表2所示。干蓮子蛋白質(zhì)中水、鹽溶性蛋白質(zhì)總含量超過總蛋白的60%，酸、堿溶性蛋白質(zhì)總量不足23%，這與唐佩華等[18]的結(jié)果一致；磨皮粉中蛋白質(zhì)組成與蓮子非常接近，除堿溶性蛋白質(zhì)含量比干蓮子低1.4%外，其他3 類蛋白質(zhì)組分無明顯差別。說明蓮子磨皮粉可以代替干蓮子用作制備蓮子蛋白質(zhì)產(chǎn)品的原料，以提高其附加值。

表2 蓮子及其磨皮粉中各種溶性蛋白質(zhì)的含量Table 2 Contents of proteins with different solubility in lotus seed and its peel waste

2.4 SDS-PAGE結(jié)果分析

圖2 蓮子及其磨皮粉中總蛋白質(zhì)及各種可溶性蛋白質(zhì)的電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE profi le of protein samples from lotus seed and its peel waste

由圖2可知，干蓮子與其磨皮粉中總蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜非常相似，前者比后者僅多一條大于120 kD的條帶，其余可清晰分辨的15～30 條蛋白條帶幾乎完全一致，含量較多的蛋白質(zhì)主要集中在15～20 kD和30～50 kD；二者水溶性和鹽溶性蛋白質(zhì)組分的SDS-PAGE圖譜均沒有明顯差別，說明二者的亞基組成特性基本一致。由于樣品制備時(shí)采用了同樣的提取條件，鹽溶性蛋白質(zhì)樣品中蛋白質(zhì)條帶信號(hào)較弱，可能未檢測到全部條帶[19-20]，但同時(shí)也說明了其含量相對于水溶性蛋白質(zhì)較低，這與表2的結(jié)果一致；酸溶性、堿溶性蛋白質(zhì)樣品中未檢測到條帶，除與含量低有關(guān)外，也可能與其點(diǎn)樣時(shí)的pH值條件及溶解性有關(guān)。

2.5 SEC-HPLC結(jié)果分析

體積排阻色譜法又稱尺寸排阻色譜法，是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法，被廣泛應(yīng)用于分析大分子物質(zhì)分子質(zhì)量的分布。

由圖3可知，二者圖譜非常相似，最大洗脫峰均出現(xiàn)在9.6 min左右，峰面積約占70%，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，分子質(zhì)量約130 kD，結(jié)合SDS-PAGE分析結(jié)果（蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量主要在15～50 kD），說明蓮子與其磨皮粉的蛋白質(zhì)主要以120～130 kD的聚合體形式存在；另外2 個(gè)峰面積大于10%的洗脫峰保留時(shí)間分別為11.3 min和12.6 min，對應(yīng)分子質(zhì)量約為14 kD和2.5 kD；此外，保留時(shí)間為5.8 min左右時(shí)，有一較小的洗脫峰，由于所用色譜柱的洗脫極限為103kD，因此分子質(zhì)量大于103kD，應(yīng)該為復(fù)雜的蛋白質(zhì)聚集體[16]。

圖3 干蓮子（A）及其磨皮粉（B）中全蛋白質(zhì)的HPLC圖譜Fig.3 HPLC of total protein in lotus seed (A) and its peel waste (B)

圖4 干蓮子（A）及其磨皮粉（B）中水溶性蛋白質(zhì)組分的HPLC圖譜Fig.4 HPLC of water soluble proteins in lotus seed (A) and its peel waste (B)

水溶性蛋白質(zhì)的SEC-HPLC色譜圖與總蛋白質(zhì)類似（圖4），干蓮子與磨皮粉的蛋白質(zhì)樣品也無明顯差異。

圖5 蓮子（A）及其磨皮粉（B）中鹽溶性蛋白質(zhì)組分的HPLC圖譜Fig.5 HPLC of salt soluble proteins in lotus seed (A) and its peel waste (B)

圖6 蓮子（A）及其磨皮粉（B）中酸溶性蛋白質(zhì)組分的HPLC圖譜Fig.6 HPLC of acid soluble proteins in lotus seed (A) and its peel waste (B)

鹽溶性和酸溶性蛋白質(zhì)組分的SEC-HPLC色譜圖（圖5、6）類似，干蓮子與磨皮粉樣品均存在一定差異：蓮子蛋白質(zhì)中檢測到的峰較多，說明分離到的蛋白質(zhì)種類稍多，但差異峰的信號(hào)都很弱，表明其含量很低；而兩種蛋白質(zhì)樣品信號(hào)較強(qiáng)的峰（如保留時(shí)間11.4 min，對應(yīng)分子質(zhì)量約為12 kD）則基本一致。

圖7 蓮子（A）及其磨皮粉（B）中堿溶性蛋白質(zhì)組分的HPLC圖譜Fig.7 HPLC of alkali soluble proteins in lotus seed (A) and its peel waste (B)

由圖7可知，干蓮子和磨皮粉堿溶性蛋白質(zhì)洗脫峰的保留時(shí)間基本相同，明顯的峰均出現(xiàn)在5.9、10.2、11.5、12.7 min左右（對應(yīng)分子質(zhì)量分別為＞1 000、60、11、2 kD），但蓮子堿溶性蛋白質(zhì)中的強(qiáng)度明顯較強(qiáng)，說明其含量較大。

3 結(jié) 論

磨皮粉為干蓮子機(jī)械磨皮的副產(chǎn)物，產(chǎn)量大，淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分豐富，其蛋白質(zhì)含量為186.54 mg/g，與蓮子的蛋白質(zhì)含量為188.10 mg/g相當(dāng)；蓮子與其磨皮粉中蛋白質(zhì)的組成非常接近，水溶性、鹽溶性蛋白質(zhì)組分含量超過總蛋白質(zhì)含量的60%，酸、堿溶性蛋白質(zhì)組分含量不足總蛋白質(zhì)含量的23%，是一種易于消化吸收的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)。SDS-PAGE分析表明，蓮子與其磨皮粉中含量較多的蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量主要集中在15～20 kD和30～50 kD，前者與后者的SDS-PAGE圖譜相比僅多一條大于120 kD的條帶，其余可清晰分辨的15～20 條蛋白帶條帶幾乎完全一致；SEC-HPLC分析表明蓮子與其磨皮粉蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布也高度相似，主要蛋白質(zhì)組分的洗脫峰幾乎完全一致，差異主要為蓮子蛋白質(zhì)中酸溶性蛋白質(zhì)的種類較多、堿溶性蛋白質(zhì)的含量較大。因此，本研究證明蓮子磨皮粉中的蛋白質(zhì)的組成特性與蓮子蛋白質(zhì)非常接近，可以用于替代蓮子用于生產(chǎn)蓮子蛋白質(zhì)粉或其他含蓮蛋白質(zhì)食品，為蓮子磨皮粉的綜合利用和提高其附加值提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。

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Comparison of Composition Characteristics of Proteins in Lotus Seed with Its Peel Waste

WANG Faxiang, HE Wei, LI Wei, YU Jian, LI Xianghong, WANG Jianhui, LIU Yongle*
(Aquatic Resource Food Processing Engineering Research Center of Hunan Province, College of Chemistry and Biology Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

The contents, subunit compositions and molecular weight distribution of total protein and proteins with different solubility in lotus seed and its peel waste were analyzed using Kjeldahl method, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE) and size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography (SEC-HPLC). The results showed that the protein contents of lotus seed and its peel waste were 188.10 and 186.54 mg/g, respectively. They were similar in terms of the composition of proteins with different solubility; water and salt soluble proteins as well as acid and alkali soluble proteins altogether represented more than 60% and less than 23% of the total proteins, respectively. The SDS-PAGE profi les of proteins from lotus seeds and its peel waste showed a high similarity, and the molecular weights of main protein subunits were 15–20 and 30–50 kD. The HPLC elution patterns of total and water soluble proteins in lotus seed and its peel waste were highly similar, indicating similar molecular weight distribution, except that the elution peaks of acid soluble proteins and relative intensity of alkali soluble proteins separated from lotus seeds were more or larger than those from its peel waste. This study proved that the peel waste had similar protein composition characteristics with lotus seed, and could be used as an alternative material for producing lotus seed protein powder or other related foods.

lotus seed; peel waste; by-products; protein; composition; comparison

TS210.9

A

1002-6630（2015）01-0059-05

10.7506/spkx1002-6630-201501011

2014-03-06

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD31B08）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201427；31101214）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（12JJ6028）

王發(fā)祥（1978—），男，副教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：wfaxiang@163.com

*通信作者：劉永樂（1962—），男，教授，博士，主要從事大宗農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究。E-mail：lyle19@163.com