米諾環(huán)素滴眼液對(duì)小鼠干眼的療效及機(jī)制研究

肖啟國，周靜，周芳，李嫻，李潔，唐羅生，劉祖國

（1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科，湖南 衡陽 421001；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院眼科，湖南 長沙 410011；3.廈門大學(xué)眼科研究所，福建 廈門 361102）

·論著·

米諾環(huán)素滴眼液對(duì)小鼠干眼的療效及機(jī)制研究

肖啟國1，周靜1，周芳1，李嫻1，李潔1，唐羅生2，劉祖國3

（1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科，湖南 衡陽 421001；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院眼科，湖南 長沙 410011；3.廈門大學(xué)眼科研究所，福建 廈門 361102）

目的探討米諾環(huán)素滴眼液對(duì)苯扎氯銨誘導(dǎo)的小鼠干眼的療效及可能機(jī)制。方法BALB/c雄性小鼠50只（100眼）使用0.2%的苯扎氯銨滴眼液滴眼誘導(dǎo)干眼。選擇嚴(yán)重程度相似的干眼小鼠隨機(jī)分為A、B、C、D 4組，分別為0.1%米諾環(huán)素滴眼液組、0.5%米諾環(huán)素滴眼液組、溶劑組及空白組。在治療前及治療后第1、3及5天，行淚膜破裂時(shí)間（BUT）、角膜炎癥指數(shù)、角膜上皮熒光素鈉染色檢查。治療結(jié)束后摘取小鼠眼球，行HE及過碘酸-希夫染色（PAS），免疫組織化學(xué)及免疫熒光檢測角膜組織角蛋白10（K10）的表達(dá)，Western blot檢測角組織中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)水平，并分析各組的差異。結(jié)果共40只小鼠（80眼）入選進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)，每組10只（20眼）。用藥前各組小鼠BUT、角膜炎癥指數(shù)、角膜上皮熒光素鈉染色差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.19、0.24和0.81；P=0.902、0.869和0.493）。用藥后第3天及第5天，A、B組較C、D組角膜炎癥程度明顯減輕（F=6.57及10.17；P=0.001和0.000），淚膜破裂時(shí)間延長（F= 5.71及5.36；P=0.003及0.004）。治療第3天，A、B組較C、D組角膜熒光素鈉染色輕（F=4.42，P=0.009）。HE染色結(jié)果顯示A、B組角膜上皮細(xì)胞形態(tài)較C、D組規(guī)整。PAS染色顯示A、B組杯狀細(xì)胞數(shù)量多于C、D組（F =15.36，P=0.007）。免疫組織化學(xué)及免疫熒光結(jié)果均顯示A、B組較C、D組K10表達(dá)減少（F=162.50，P= 0.000）。Western blot顯示A、B組較C、D組IL-1β、TNF-α表達(dá)明顯降低（F=6.84及11.60；P=0.006及0.001）。結(jié)論米諾環(huán)素對(duì)苯扎氯銨誘導(dǎo)的小鼠干眼有一定的治療作用，其機(jī)制可能與其抑制眼表炎癥及鱗狀上皮化生有關(guān)。

干眼；米諾環(huán)素；小鼠；炎癥；鱗狀上皮化生

干眼是一種常見的淚液與眼表多因素疾病，患病率達(dá)5%～34%[1]。輕度干眼可引起眼部干澀、燒灼、疼痛、易疲勞等眼部刺激癥狀，若無規(guī)范治療，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致角膜上皮持續(xù)損害、角膜新生血管形成及眼表鱗狀上皮化生等眼表異常，從而產(chǎn)生視力障礙，甚至致盲[2]。

大量的研究已經(jīng)證實(shí)，眼表炎癥是干眼發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抗炎已經(jīng)成為治療干眼（尤其是中重度干眼）的重要手段[1]。目前治療干眼常用的抗炎藥物主要有皮質(zhì)類固醇或環(huán)孢素A滴眼液等，然而長期使用皮質(zhì)類固醇滴眼液存在誘發(fā)青光眼及白內(nèi)障的潛在風(fēng)險(xiǎn)，而環(huán)孢素滴眼液則存在降低眼表免疫力及刺激性強(qiáng)等缺點(diǎn)[2-3]，因此，開發(fā)新的安全有效的治療干眼的局部抗炎藥物具有重要的臨床意義。

米諾環(huán)素屬第二代半合成長效四環(huán)素衍生物，是一種廣譜抗生素，此外，米諾環(huán)素還具有抗炎、抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)等多種特性[4-5]，尤其是其抗炎特性近年來越來越受重視。目前米諾環(huán)素的抗炎作用已被用于治療多種免疫及炎性相關(guān)疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、大皰性皮膚病、炎癥性腸炎等[6-8]。在眼部也有報(bào)道米諾環(huán)素可以抑制視神經(jīng)炎模型小鼠炎癥基因的表達(dá)、減少白細(xì)胞粘附及趨化的作用[9]。這些研究表明，米諾環(huán)素可對(duì)多種組織發(fā)揮抗炎作用。然而，米諾環(huán)素對(duì)干眼的抗炎及治療是否起作用至今未見報(bào)道。本研究通過建立苯扎氯銨誘導(dǎo)的小鼠干眼模型，探討米諾環(huán)素滴眼液對(duì)小鼠干眼的治療效果和可能機(jī)制，以便為臨床上開發(fā)新的治療干眼的藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑

BALB/C小鼠（上海SLAC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），米諾環(huán)素粉劑（Sigma，美國），苯扎氯銨粉劑（Sigma，美國），熒光素鈉液（天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司），蘇木素染色試劑（Solarbio，美國），伊紅染色試劑（Solarbio，美國），PAS染色劑（Promega，美國），IL-1β抗體（Abcam，美國），TNF-α抗體（Abcam，美國），K10抗體（Abcam，美國），GADPH抗體（Abcam，美國），熒光二抗FITC（Dako，美國），熒光二抗AlexaFluo488（Dako，美國），蛋白定量試劑盒（BIO-RAD，美國），Westernblot顯色反應(yīng)劑化學(xué)發(fā)光法（ECL）試劑盒（BIO-RAD，美國）。

1.2苯扎氯銨溶液及米諾環(huán)素滴眼液的配制

1.2.1苯扎氯銨溶液配制簡要步驟稱取0.2 g苯扎氯銨粉末，加入99.8 ml去離子水中，攪拌后放置24 h，待苯扎氯銨粉末完全溶解后，用EP管分裝，置于常溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2米諾環(huán)素滴眼液配制簡要步驟將等量的去離子水及甘油混勻，根據(jù)滴眼液所需濃度不同稱取不同量米諾環(huán)素粉末加入到100 ml去離子水及甘油混合液中，充分?jǐn)嚢枞芙?，加入磷酸緩沖對(duì)調(diào)節(jié)pH值，使米諾環(huán)素滴眼液終濃度分別為0.1%及0.5%。用EP管分裝，置于4℃冰箱避光保存。

1.3實(shí)驗(yàn)過程

1.3.1小鼠干眼模型的構(gòu)建雄性BALB/c小鼠60只（共120眼），體重18～20 g，健康且無眼表異常。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度（60±10）%，模擬燈光晝夜更替（9 AM～9 PM）。其中50只小鼠（100眼）予以0.2%苯扎氯銨溶液滴眼，2次/d（早8∶00，晚18∶00），5μl/次，持續(xù)14 d誘導(dǎo)干眼模型[10]，剩余10只（20眼）不作任何處理，作為基線對(duì)照。

1.3.2小鼠干眼模型的評(píng)價(jià)及篩選用藥第15天根據(jù)淚膜破裂時(shí)間淚膜破裂時(shí)間（break-up time，BUT）、角膜熒光素鈉染色及角膜炎癥指數(shù)評(píng)分篩選干眼模型，BUT：在小鼠結(jié)膜囊內(nèi)滴入1%的熒光素鈉溶液1μl，將其瞬目3次后，張大瞼裂，秒表計(jì)時(shí)，記下最后1次瞬目到角膜出現(xiàn)第1個(gè)黑斑的時(shí)間。重復(fù)3次，取平均值。篩選條件：BUT（2.5±0.5）s。

角膜熒光素鈉染色：小鼠結(jié)膜囊內(nèi)滴入1%的熒光素鈉溶液1滴，1 min后，裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察角膜上皮熒光素鈉染色情況。評(píng)分參照Pauly A等的標(biāo)準(zhǔn)[11]，角膜分為4個(gè)象限，每象限0～4分，總分為16分。0分：無著染；1分：點(diǎn)狀著染，但少于30個(gè)；2分：著染點(diǎn)數(shù)多于30個(gè)，但不彌散；3分：明顯彌散著染但無斑塊狀染色；4分：斑塊狀染色。篩選條件：角膜熒光素染色總分12分以上。

角膜炎癥指數(shù)評(píng)分：角膜炎癥指數(shù)由3個(gè)參數(shù)定量組成[12]：中央角膜水腫（0分：無水腫；1分：輕度水腫，虹膜紋理清晰；2分：中度水腫，虹膜紋理不清；3分：嚴(yán)重水腫，虹膜瞳孔窺不見）；周邊角膜水腫（評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)同中央角膜水腫）；睫狀充血（0分：無充血；1分：有充血帶但其寬度小于1 mm；2分：充血帶寬度在1～2mm之間；3分：充血帶寬度大于2 mm）。分別評(píng)分后將3部分指數(shù)相加并除以系數(shù)9，即為該眼角膜炎癥指數(shù)。篩選條件：炎癥指數(shù)大于5/9。1.3.3干眼模型的分組及處理根據(jù)上述指標(biāo)選出符合條件的干眼模型小鼠40只（80眼），隨機(jī)分為A、B、C及D 4組。其中A組滴用0.1%米諾環(huán)素滴眼液，3次/d；B組滴用0.5%米諾環(huán)素滴眼液，3次/d；C組滴用不含米諾環(huán)素的溶劑（溶劑組），3次/d；D組不予任何處理（空白組）。治療后第1、3及5天分別行BUT、角膜熒光素鈉染色及角膜炎癥指數(shù)評(píng)分檢查（方法同前），治療5天后處死實(shí)驗(yàn)小鼠，立即摘除眼球，取下相應(yīng)組織行實(shí)驗(yàn)室檢查。

1.4實(shí)驗(yàn)室檢查

1.4.1HE及PAS染色按照常規(guī)病理染色操作。

1.4.2K10免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色石蠟切片加3%過氧化氫室溫下孵育，以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶活性，PBS液沖洗；加人一抗K10（1∶300），4℃過夜；PBS液沖洗，加入二抗，室溫下孵育，DAB

顯色，蘇木素復(fù)染后封片。

1.4.3K10免疫熒光染色取新鮮眼球組織OCT包埋，液氮預(yù)冷后置于-80℃冰箱保存。冷凍切片，冷丙酮固定，PBS洗滌，0.1%TritonX-100透膜；PBS浸洗，5%BSA常溫下封閉；加一抗K10（1∶400），4℃過夜；PBS浸洗，加熒光二抗，室溫濕盒內(nèi)避光孵育；PBS浸洗，DAPI復(fù)染并封片。

1.4.4Western blot蛋白檢測角膜組織充分剪碎勻漿，加入RIPA裂解液裂解，4℃下高速離心，取上清液BIO-RAD蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。制備電泳凝膠，加入樣品及Marker，SDS電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，加一抗TNF-α抗體（1∶500），IL-1β抗體（1∶500），GADPH抗體（1∶10 000）孵育，4℃低頻搖晃過夜，漂洗濾膜，加入二抗（1∶2 000），常溫下孵育后PBST浸洗，ECL顯影。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism5.01進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行組間比較應(yīng)用單因素方差分析，滿足方差齊性時(shí)，采用Tukey顯著性檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，非方差齊性時(shí)，采用Dunnet-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1治療前各組小鼠臨床指標(biāo)情況

治療前A、B、C及D組的眼表炎癥評(píng)分、淚膜破裂時(shí)間及角膜上皮熒光素鈉染色評(píng)分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖1 用藥3 d后各組干眼小鼠角膜上皮熒光素鈉染色代表性圖片

2.2治療后各組小鼠臨床指標(biāo)的變化

治療第1天，各組小鼠淚膜破裂時(shí)間、角膜熒光素染色及炎癥指數(shù)評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。治療第3及5天，A、B組較C、D組炎癥指數(shù)評(píng)分降低（F=6.57及10.17；P=0.001，0.000），淚膜破裂時(shí)間明顯延長（F=5.71，5.36；P=0.003，0.004）。治療第3天，A、B組較C、D組角膜熒光素鈉染色輕（F=4.42，P=0.009）（見圖1），治療第5天各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.89，P=0.146）。治療第3及5天，A組與B組及C組與D組之間淚膜破裂時(shí)間、角膜熒光素染色及炎癥指數(shù)評(píng)分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3治療后各組小鼠角膜HE染色情況

HE染色結(jié)果顯示，空白組及溶劑組角膜上皮細(xì)胞層出現(xiàn)異常增大的空泡樣細(xì)胞，表層上皮欠光滑，角膜基質(zhì)內(nèi)見少許炎癥細(xì)胞。米諾環(huán)素滴眼液治療組角膜上皮相較于空白組及溶劑組角膜上皮細(xì)胞形態(tài)更規(guī)整（見圖2）。

圖2 治療第5天后角膜HE染色圖（×400）

圖3 治療第5天后角膜IL-1β、TNF-αwestern blot檢查結(jié)果

圖4 治療第5天各組結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度

2.4米諾環(huán)素滴眼液對(duì)干眼小鼠角膜TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示苯扎氯銨誘導(dǎo)的干眼小鼠角膜炎癥因子TNF-α、IL-1β較正常小鼠明顯增多，而經(jīng)米諾環(huán)素滴眼液治療后，TNF-α、IL-1β表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.84及11.6；P=0.006及0.001）（圖3）。

2.5米諾環(huán)素滴眼液對(duì)小鼠干眼眼表鱗狀上皮化生的影響

2.5.1結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量的變化結(jié)膜穹隆部石蠟切片行PAS染色顯示，空白組及溶劑組結(jié)膜杯狀細(xì)胞明顯少于正常結(jié)膜，經(jīng)米諾環(huán)素滴眼液治療后結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.36，P=0.007）（圖4）。

2.5.2K10表達(dá)的變化免疫組織化學(xué)及免疫熒光染色結(jié)果均顯示，正常組角膜上皮基本不表達(dá)K10，而空白組及溶劑組小鼠角膜上皮均可見K10的表達(dá)，米諾環(huán)素滴眼液治療組K10表達(dá)少于空白組及溶劑組（F=162.50，P=0.000）（圖5）。

圖5 治療第5天后角膜上皮K10表達(dá)情況

3 討論

苯扎氯銨是臨床滴眼液中常用的防腐劑，也是臨床上引起干眼的常見因素。苯扎氯銨誘導(dǎo)的小鼠干眼模型不僅臨床表現(xiàn)類似于人類干眼，而且病理改變也與人類干眼十分相似，包括眼表炎癥、角膜上皮細(xì)胞凋亡與鱗狀上皮化生、杯狀細(xì)胞的丟失、淚膜穩(wěn)定性受損等[10]。故本實(shí)驗(yàn)采用苯扎氯銨滴眼液誘導(dǎo)的小鼠干眼模型來探討米諾環(huán)素滴眼液對(duì)干眼的治療作用及可能機(jī)制。

筆者通過對(duì)小鼠滴用苯扎氯銨滴眼液14 d，成功地誘導(dǎo)了與LIN等[10]報(bào)道類似的小鼠干眼的發(fā)生。通過對(duì)這些干眼小鼠使用米諾環(huán)素滴眼液進(jìn)行治療，筆者發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素滴眼液能夠延長干眼小鼠的淚膜破裂時(shí)間、減輕角膜上皮熒光素鈉染色及降低角膜炎癥指數(shù)評(píng)分，證明米諾環(huán)素滴眼液對(duì)苯扎氯銨滴眼液誘導(dǎo)的小鼠干眼具有一定的治療作用。為進(jìn)一步證實(shí)米諾環(huán)素對(duì)小鼠干眼的治療作用并探討其可能的機(jī)制，筆者從組織病理學(xué)及分子生物學(xué)水平研究了米諾環(huán)素滴眼液對(duì)干眼小鼠角膜上皮細(xì)胞形態(tài)、眼表炎癥及鱗狀細(xì)胞化生等的影響。

眼表上皮與淚膜互相依賴和影響。眼表上皮受損不僅是干眼的表現(xiàn)，它反過來又可以加重干眼的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，滴用米諾環(huán)素滴眼液后，不僅干眼小鼠角膜上皮熒光素鈉染色減輕，而且HE染色發(fā)現(xiàn)角膜上皮形態(tài)更加規(guī)整，說明米諾環(huán)素滴眼液可以減輕干眼小鼠角膜上皮的損傷，從而對(duì)干眼產(chǎn)生治療作用。

炎癥是干眼發(fā)病的關(guān)鍵因素。IL-1β與TNF-α是干眼發(fā)病中十分常見而重要的炎癥因子。既往的研究已經(jīng)證實(shí)，IL-1β與TNF-α在各種類型的干眼患者及動(dòng)物模型中均呈現(xiàn)高表達(dá)[13]。干眼的結(jié)膜及角膜上皮本身均可以產(chǎn)生IL-1β和TNF-α，它們不僅對(duì)干眼眼表炎癥的發(fā)生及發(fā)展具有重要作用，而且其表達(dá)水平與干眼的嚴(yán)重程度成正相關(guān)[14]。這些發(fā)現(xiàn)使得IL-1β及TNF-α成為能夠準(zhǔn)確反應(yīng)干眼慢性眼表炎癥的代表性因子。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，經(jīng)苯扎氯銨滴眼液誘導(dǎo)的小鼠干眼角膜中IL-1β及TNF-α表達(dá)明顯增加，而米諾環(huán)素滴眼液能夠顯著抑制干眼小鼠IL-1β及TNF-α的表達(dá)，這與臨床指標(biāo)檢查米諾環(huán)素滴眼液治療組小鼠角膜炎癥指數(shù)評(píng)分減輕一致。這些數(shù)據(jù)表明米諾環(huán)素滴眼液能夠抑制苯扎氯銨滴眼液誘導(dǎo)的小鼠干眼模型的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與米諾環(huán)素滴眼液抑制IL-1β、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生相關(guān)，但確切的信號(hào)通路尚需進(jìn)一步研究。

眼表鱗狀上皮化生是中、重度干眼常見的病理改變，也是干眼病情惡化的表現(xiàn)。有研究表明眼表鱗狀上皮化生分為3個(gè)階段：①杯狀細(xì)胞丟失；②細(xì)胞層數(shù)增多或表皮細(xì)胞增大；③角質(zhì)化[15]。鱗狀上皮化生從杯狀細(xì)胞丟失的基礎(chǔ)上進(jìn)展而來，最后的結(jié)果是使具有分泌功能的非角化上皮化生為無分泌功能的角化上皮。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過苯扎氯銨滴眼液誘導(dǎo)的干眼小鼠角膜上皮細(xì)胞層出現(xiàn)異常增大的空泡樣細(xì)胞，結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度明顯降低，反應(yīng)上皮角化的特異性標(biāo)志物K10表達(dá)陽性[16]，說明苯扎氯銨滴眼液誘導(dǎo)的干眼小鼠眼表上皮發(fā)生了明顯的鱗狀上皮化生。而滴用米諾環(huán)素滴眼液后，角膜上皮細(xì)胞形態(tài)更加規(guī)整，杯狀細(xì)胞數(shù)目顯著增多，K10的表達(dá)明顯減少，表明米諾環(huán)素滴眼液能抑制干眼小鼠的眼表鱗狀上皮化生。由于干眼眼表鱗狀上皮化生與眼表長期的炎癥密切相關(guān)[17]，而米諾環(huán)素滴眼液具有抑制干眼眼表炎癥的作用，因此，筆者推測米諾環(huán)素滴眼液抑制干眼眼表鱗狀上皮化生，可能與米諾環(huán)素滴眼液能夠抑制干眼眼表炎癥有關(guān)。

值得注意的是，治療后第5天，米諾環(huán)素治療組與空白及溶劑對(duì)照組角膜熒光素鈉染色并無差異，可能與小鼠角膜上皮具有較強(qiáng)的自我修復(fù)功能，使得隨著時(shí)間推移，各組間的角膜熒光素鈉染色差異逐漸不明顯有關(guān)。此外，整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，0.5%米諾環(huán)素滴眼液并未表現(xiàn)出比0.1%米諾環(huán)素滴眼液更強(qiáng)的治療作用及抗炎效果，可能與本實(shí)驗(yàn)使用滴眼液的制劑工藝不足有關(guān)。因?yàn)槊字Z環(huán)素是一種呈酸性的脂溶性抗生素，隨著藥物配制濃度的增加，可能存在藥物溶解不充分及藥物的pH值下降，從而降低了藥物的有效治療濃度，增加了藥物對(duì)眼表的刺激。因此，改進(jìn)米諾環(huán)素滴眼液的制劑工藝，是接下來亟需研究的課題。

總之，筆者的研究表明，米諾環(huán)素滴眼液對(duì)苯扎氯銨誘導(dǎo)的小鼠干眼模型具有一定的治療作用，其機(jī)制可能與米諾環(huán)素能抑制干眼眼表炎癥及減輕眼表鱗狀上皮化生有關(guān)。這一結(jié)果為開發(fā)新的治療干眼的藥物提供了一定的依據(jù)。

[1]MA L.The definition and classification of dry eye disease:reportof the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop(2007)[J].Ocul Surf,2007,5(2):75-92.

[2]MESSMER EM.The pathophysiology,diagnosis,and treatment of dry eye disease[J].Dtsch Arztebl Int,2015,112(5):71-81.

[3]JUNG HH,JI YS,SUNG MS,et al.Long-Term outcome of treatment with topical corticosteroids for severe dry eye associated withsjogren'ssyndrome[J].ChonnamMed,2015,51(1): 26-32.

[4]OSSOLA B,LANTTO TA,PUTTONEN KA,et al.Minocycline protects SH-SY5Y cells from 6-hydroxydopamine by inhibiting both caspase-dependent and-independent programmed cell death [J].Neurosci Res,2012,90(3):682-690.

[5]JIAO X,Y PENG,L YANG.Minocycline protects retinal ganglion cells after optic nerve crush injury in mice by delaying autophagy and upregulating nuclear factor-kappaB2[J].Chin Med (Engl),2014,127(9):1749-1754.

[6]任韻清,楊森,張學(xué)軍.米諾環(huán)素應(yīng)用新進(jìn)展[J].中華皮膚科雜志, 2005,12(7):777-778.

[7]JACKSON JM,LH KIRCIK,DJ LORENZ.Efficacy of extended-release 45 mg oral minocycline and extended-release 45 mg oral minocycline plus 15%azelaic acid in the treatment of acne rosacea[J].Drugs Dermatol,2013,12(3):292-298.

[8]BERNARDINO AL,D KAUSHAL,MT PHILIPP.The antibiotics doxycycline and minocycline inhibit the inflammatory responses to the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi[J].Infect Dis, 2009,199(9):1379-1388.

[9]ABCOUWER SF,LIN CM,SHANMUGAM S,et al.Minocycline prevents retinal inflammation and vascular permeability following ischemia-reperfusion injury[J].Neuroinflammation,2013(10):149.

[10]LIN Z,LIU X,ZHOU T,et al.A mouse dry eye model induced by topical administration ofbenzalkoniumchloride[J]. Mol Vis,2011(17):257-264.

[11]PAULY A,BRIQNOLE-BAUBOUIN F,LABBE A,et al.New tools for the evaluation of toxic ocular surface changes in the rat[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48(12):5473-5483.

[12]LARIA C,ALIóJL,RUIZ-MORENóJM.Combined non-steroidal therapy in experimental corneal injury[J].Ophthalmic Res,1997, 29(3):145-53.

[13]LUO L,LI DQ,DOSHI A,et al.Experimental dry eye stimulates production of inflammatory cytokines and MMP-9 and activates MAPK signaling pathways on the ocular surface[J].Investigative Ophthalmology&Visual Science,2004,45(12):4293-4301.

[14]YIHUI CHEN,XIAOYAN ZHANG,LING YANG,et al.Decreased PPAR-gamma expression in the conjunctiva and increased expression of TNF-alpha and IL-1beta in the conjunctiva and tear fluid of dry eye mice[J].Molecular medicine reports,2014,9(5):2015-2023.

[15]TSENG SC.Staging of conjunctival squamous metaplasia by impression cytology[J].Ophthalmology,1985,92(6):728-733.

[16]W LI,Y HAYASHIDA,YT CHEN,et al.Air exposure induced squamous metaplasia of human limbal epithelium[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(1):154-162.

[17]KUNERT,KS,AS TISDALE,et al.Goblet cell numbers and epithelial proliferation in the conjunctiva of patients with dry eye syndrome treated with cyclosporine[J].Archives of Ophthalmology,2002,120(3):330-337.

（王榮兵 編輯）

Therapeutic effects and mechanism of minocycline eye drops in a murine model of dry eye

Qi-guo XIAO1,Jing ZHOU1,Fang ZHOU1,Xian LI1,Jie LI1,Luo-sheng TANG2,Zu-guo LIU3
(1.Department of Ophthalmology,the Second Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang,Hunan 421001,P.R.China;2.Department of Ophthalmology,the Second Xiangya Hospital of Central South University,Changsha,Hunan 410011,P.R.China;3.Eye Institute of Xiamen University,Xiamen,Fujian 361102,P.R.China)

【Objective】To investigate the effects of minocycline eye drops on dry eye in a mouse model induced by topical benzalkonium chloride(BAC)and outline the mechanism.【Methods】Fifty male BALB/c mice were treated with topical administration of 0.2%BAC to induce dry eye.According to clinical evaluations including tear break-up time(BUT),corneal fluorescein staining scores and inflammation index on day(D)15 after the BAC treatment,the similar severity dry eye mice(80 eyes）were selected and randomly divided into four groups:A(0.1% minocycline-treated group),B(0.5%minocycline-treated group),C(solvent-treated group),and D(blank group). Clinical evaluations including BUT,corneal fluorescein staining,and inflammatory index were performed on D1,D3 and D5 after treatment.Eyeballs were collected on D5 and evaluated by histologic investigation,immunostaining using antibodies against cytokeratin 10 in the cornea was performed,and goblet cells were detected by the periodic acid-Schiff(PAS)assay.The levels of IL-1β,TNF-α were measured by Western blot.【Results】Eighty eyes wereincluded in the sequential experiment,20 eyes for each group.There were no clinical differences among the groups before the treatment.Lower inflammatory index scores and longer BUT were recorded on D3 and D5 in minocyclinetreated eyes,and lower corneal fluorescein staining scores were recorded on D3 in minocycline-treated eyes.The expression of cytokeratin 10 was reduced in minocycline-treated eyes.The expressions of IL-1β,TNF-α were inhabited in minocycline-treated eyes.In addition,minocycline relatively increased the number of goblet cells.【Conclusion】Topical minocycline application produced improvements in dry eye,most likely by inhibiting inflammation and squamous metaplasia.

dry eye;minocycline eye drops;mice;inflammation;squamous metaplasia

R772.2；R777.3

A

1005-8982（2015）25-0001-07

2015-05-18

國家自然科學(xué)基金（No：81270978）；湖南省衛(wèi)生計(jì)劃生育委員會(huì)基金（No：2015-57）