DnaJ－like蛋白在植物脅迫應(yīng)答中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展

黃守程，葉梅榮，劉愛榮 （安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng)233100）

張遠(yuǎn)兵 （安徽科技學(xué)院城建與環(huán)境學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng)233100）

植物在生長(zhǎng)發(fā)育的過程中會(huì)遭受多種環(huán)境因子脅迫，如高（低）溫、強(qiáng)（弱）光、干旱（洪水）、高鹽、重金屬、病原菌（或病毒）侵染等，當(dāng)這些因素造成的影響超過一定的限度就會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生傷害［1］。脅迫導(dǎo)致植物生長(zhǎng)狀況的改變和代謝的失衡，進(jìn)而引起植物通過改變體內(nèi)的代謝途徑來(lái)進(jìn)行脅迫應(yīng)答［2］。熱激蛋白（heat－shock proteins，HSPs）是生物遭受脅迫（如干旱、低溫、重金屬離子等）之后大量產(chǎn)生的一類特殊蛋白質(zhì)［3］，HSPs在結(jié)構(gòu)上極為保守，具有分子伴侶功能，參與生物體內(nèi)新生肽的運(yùn)輸、折疊、組裝、定位以及變性蛋白的復(fù)性和降解［4］。DnaJ（HSP40）是最早在Escherichiacoli中發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)蛋白［5］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)動(dòng)物、植物以及真菌中廣泛存在與DnaJ功能相似的蛋白，稱為DnaJ－like蛋白［6～8］。DnaJ－like蛋白廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)多個(gè)細(xì)胞器，如細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、液泡以及細(xì)胞骨架［9］，參與植物的形態(tài)建成［10］、葉綠體運(yùn)動(dòng)［11］以及多種脅迫應(yīng)答反應(yīng)［12～14］。大量研究表明，DnaJ－like蛋白在植物的生物與非生物脅迫中具有非常重要的作用。

1 DnaJ蛋白的結(jié)構(gòu)及功能

DnaJ是一種重要的分子伴侶蛋白，DnaJ結(jié)構(gòu)域是一個(gè)大約由70個(gè)氨基酸組成保守結(jié)構(gòu)域，其核心結(jié)構(gòu)是His／Pro／Asp三肽［15］。一般包含4個(gè)功能域：N－末端保守的J功能域（J domain）、富含甘氨酸結(jié)構(gòu)域（G／P domain）、含4個(gè)CXXCXGXG重復(fù)基序的中央富含Cys區(qū)域（CRR domain）以及1個(gè)由120～170氨基酸組成的C－端低同源結(jié)構(gòu)域（CTD domain）［16］。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，DnaJ蛋白家族成員可分為3種類型：類型I——同時(shí)含有J、G／P和CRR等3個(gè)結(jié)構(gòu)域，類型II——含有J、G／P等2個(gè)結(jié)構(gòu)域，類型Ⅲ——只含有J結(jié)構(gòu)域［17］。CRR domain中的2個(gè)鋅原子與4個(gè)半胱氨酸殘基形成鋅指結(jié)構(gòu)域，協(xié)助DnaJ蛋白特異性地識(shí)別并結(jié)合到變性的蛋白質(zhì)底物上［18，19］。

DnaJ蛋白在維持脅迫條件下細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)以及蛋白復(fù)合體的穩(wěn)定性方面具有重要作用［12］。HSPA70（DnaK）是一類重要的分子伴侶，在生物與非生物脅迫中具有極其重要的作用，被稱為脅迫蛋白，但其活性受到DnaJ蛋白的調(diào)節(jié)［20］。DnaJ蛋白的J domain是主要的功能域，促進(jìn)HSP70的ATPase活性，調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合體的折疊、組裝與解聚［17］，而這一過程需要DnaJ、GrpE和DnaK的共同協(xié)作才得以完成。DnaJ能夠增強(qiáng)DnaK與其底物的親和性，促進(jìn)與底物的結(jié)合并形成DnaJ－substrate－DnaK－ATP復(fù)合體［21］，最后在GrpE的協(xié)助下，利用ATP水解，促進(jìn)DnaK的釋放，重新參與循環(huán)［22］（圖1）。

圖1 DnaJ與Hsp70相互作用

2 Dnaj－like蛋白的亞細(xì)胞定位及其作用機(jī)制

Dnaj－like蛋白廣泛存在于生物體中。例如，釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中有22個(gè)J蛋白，而擬南芥中則存在120個(gè)J蛋白［9］。DnaJ蛋白的功能與其在細(xì)胞內(nèi)的定位有關(guān)。計(jì)算機(jī)模擬分析發(fā)現(xiàn)擬南芥J蛋白分布于不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。在120個(gè)J蛋白中，其中50個(gè)定位于胞質(zhì)溶膠，19個(gè)定位于線粒體，12個(gè)定位于葉綠體，9個(gè)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，3個(gè)在細(xì)胞骨架，1個(gè)在細(xì)胞質(zhì)膜，2個(gè)在液泡，其余24個(gè)定位于細(xì)胞核［9］。

DnaJ蛋白參與多肽鏈的裝配和運(yùn)輸。胞質(zhì)溶膠中與核糖體結(jié)合的J蛋白能夠阻止多肽鏈合成過程中的肽鏈聚合，從而保護(hù)蛋白質(zhì)的合成［23］。atDjB8與酵母鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（Caj1）是同源蛋白，在核轉(zhuǎn)運(yùn)和RNA剪接中具有重要作用［24］。atDjC22是酵母Erj5的同源基因，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊和未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response）［25］。atDjC20和atDjC21是酵母Sec63的同源蛋白，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)［26］。蛋白質(zhì)前體（preprotein）進(jìn)入線粒體基質(zhì)是由線粒體內(nèi)膜上的J蛋白——Pam18和Pam16與 Hsp70互作介導(dǎo)的［27，28］。

DnaJ蛋白影響mRNA的剪接或small RNA的合成。大豆DnaJ－like蛋白——GmHSP40.1，與HcRed－SE和SR33－YFP共表達(dá)于細(xì)胞核中，參與pre－mRNA的剪切和mRNA的成熟，或者參與small RNA的生物合成［29］。DnaJ蛋白還可以調(diào)控主宰酶（H＋－ATPase）的活性。質(zhì)膜H＋－ATPase（PM H＋－ATPase）在細(xì)胞許多生命活動(dòng)過程中具有重要作用。PKS5負(fù)調(diào)控質(zhì)膜H＋－ATPase活性，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥J3蛋白能夠通過與PKS5激酶互作并抑制其活性，進(jìn)而正調(diào)控質(zhì)膜H＋－ATPase的活性［13］。

Dnaj－like蛋白參與信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。atDjC18是一個(gè)auxilin－like J蛋白（JAC1），調(diào)控向光素介導(dǎo)的葉綠體運(yùn)動(dòng)，從而參與光信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Chen等［30］發(fā)現(xiàn)擬南芥的1個(gè)葉綠體DnaJ－like蛋白—AtJ8，該蛋白基因在強(qiáng)光下表達(dá)完全受抑，而僅在弱光及黑暗下表達(dá)，且其表達(dá)可在光／暗條件下發(fā)生轉(zhuǎn)換，表明其可能與植物光周期有關(guān)。細(xì)胞骨架是重力信號(hào)感受器，atDjB11（ARG1）、atDjB12（ARL1）和atDjB13（ARL2）與細(xì)胞骨架相互作用而參與重力信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)［31，32］，進(jìn)一步的研究表明，ARG1和ARL2通過降低胞質(zhì)H＋濃度和影響生長(zhǎng)素的分布來(lái)參與重力感知細(xì)胞的早期向地性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［33］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)正常的折疊與修飾，逆境導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積累大量未折疊的蛋白質(zhì)，損害細(xì)胞的功能。當(dāng)植物處于脅迫環(huán)境下，DnaJ蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶binding immunoglobulin protein（BIP）相互作用［34，35］，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫感受器（ER stress sensors），釋放膜相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子bZIP28并離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在高爾基體內(nèi)被水解釋放出轉(zhuǎn)錄激活域，然后進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)［36］。

3 DnaJ－like蛋白在植物生物與非生物脅迫中的作用

3.1 DnaJ－like蛋白在植物生物脅迫（biotic stress）中的作用

研究表明，DnaJ－like蛋白在植物的防御中具有多種重要作用。Liu等［29］研究發(fā)現(xiàn)，大豆J domain類型的DnaJ－like的蛋白GmHSP40.1在煙草（Nicotianabenthamiana）中過表達(dá)導(dǎo)致煙草葉片的過敏性細(xì)胞死亡；該蛋白基因定位于細(xì)胞核，GmHSP40.1的沉默導(dǎo)致大豆對(duì)花葉病毒（Soybean mosaic virus）的敏感性增強(qiáng)，表明GmHSP40.1在大豆細(xì)胞死亡以及抗病反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用。Tobacco stress－induced1（Tsi1）是一個(gè)乙烯響應(yīng)因子結(jié)合蛋白／AP2類型的轉(zhuǎn)錄因子。Tsi1－interacting protein1（Tsip1）是一個(gè)DnaJ－like鋅指蛋白，能夠與Tsi1相互作用；水楊酸、乙烯、赤霉素、NaCl以及病毒處理均能促進(jìn)Tsip1的轉(zhuǎn)錄水平；轉(zhuǎn)基因煙草中共表達(dá)Tsip1和Tsi1能顯著增強(qiáng)對(duì)病原菌以及鹽脅迫的抗性［37］。Hofius等［38］研究發(fā)現(xiàn)煙草馬鈴薯Y病毒（PVY）的衣殼蛋白（capsid protein，CP）能夠與一系列DnaJ－like蛋白（NtCPIPs）相互作用，過表達(dá)NtCPIP1和NtCPIP2a的J－domain缺失突變體能顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)PVY的抵抗能力，表明NtCPIPs介導(dǎo)了煙草對(duì)PVY的易感性。Susanne等［39］鑒定出1個(gè)番茄（Lycopersiconesculentum）DnaJ－like蛋白基因，受番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)。有趣的是，該DnaJ－like蛋白缺乏CRR結(jié)構(gòu)域，而含有1個(gè)賴氨酸富集結(jié)構(gòu)域（KXXXKE／K）。進(jìn)一步的研究表明，該DnaJ－like蛋白介導(dǎo)了病毒蛋白在宿主體內(nèi)的移動(dòng)。同樣地，煙草DnaJ－like蛋白NtMPIP1通過與煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）的運(yùn)動(dòng)蛋白（movement protein，MP）相互作用，促進(jìn)病毒在植物體內(nèi)細(xì)胞之間的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移（cell－tocell spread），而NtMPIP1基因的沉默則顯著抑制TMV的體內(nèi)擴(kuò)散［40］。在茉莉酸介導(dǎo)的油菜（Brassicajuncea）防御反應(yīng)中，DnaJ－like蛋白表達(dá)上調(diào)，并協(xié)同其他脅迫應(yīng)答基因，對(duì)減少油菜芥末蚜蟲［Lipaphiserysimi（Kalt.）］的數(shù)量有重要作用［41］。Wang等［42］發(fā)現(xiàn)了1個(gè)番茄葉綠體的 DnaJ－like蛋白（LeCDJ2），受到水楊酸、干旱以及病原菌的誘導(dǎo)表達(dá)，過表達(dá)LeCDJ2基因顯示出對(duì)青枯假單胞桿菌（Pseudomonassolanacearum）的抗性。有意思的是，HopI1是丁香假單胞菌（Pseudomonassyringae）的毒性效應(yīng)器，是一個(gè)DnaJ－like蛋白，在擬南芥中表達(dá)該基因，發(fā)現(xiàn)其定位于葉綠體并能導(dǎo)致類囊體變長(zhǎng)以及基粒腫脹，抑制葉綠體水楊酸積累，進(jìn)而抑制水楊酸介導(dǎo)的防御反應(yīng)［43］。綜上所述，DnaJ－like蛋白具有差異化的防御能力，有的能夠增強(qiáng)植物的抗病反應(yīng)能力，而有的則降低了植物的抗病反應(yīng)能力，增強(qiáng)了植物對(duì)病原菌的易感性。

3.2 DnaJ－like蛋白在植物非生物脅迫（abiotic stress）中的作用

3.2.1 溫度脅迫

Rampuria等［44］通過SSH文庫(kù)分析篩選出一個(gè)DnaJ－like蛋白（JK266046），半定量PCR分析顯示該蛋白在42℃熱處理5min表達(dá)量是對(duì)照的10倍。Kong等［12，45］研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)葉綠體的DnaJ蛋白（LeCDJ1）能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因番茄的耐高溫能力，同時(shí)能夠增強(qiáng)低溫下光合膜的穩(wěn)定性。AtDjB1屬于擬南芥DnaJ／J－domain的蛋白家族的一個(gè)成員，能夠保護(hù)細(xì)胞，防止高溫脅迫誘發(fā)的活性氧造成的氧化損傷，從而提高擬南芥的耐熱性［14］。大豆GmDjp1編碼1個(gè)J domain類型的DnaJ－like蛋白，定位于細(xì)胞核，其轉(zhuǎn)錄水平受高溫、低溫、脫水等多種脅迫的誘導(dǎo)而上升，異源表達(dá)能夠顯著提高大腸桿菌（E.coli）的耐熱性，表明該基因在響應(yīng)高溫及其他非生物脅迫中具有重要作用［46］。相反地，定位于細(xì)胞核的擬南芥AtDjC53基因，編碼1個(gè)J domain類型的蛋白，負(fù)調(diào)控?cái)M南芥的耐熱性，其機(jī)制可能是AtDjC53的表達(dá)導(dǎo)致一些關(guān)鍵的HSP基因（如Hsp25.3－P和 Hsa32）表達(dá)受抑［47］。

3.2.2 水分和鹽脅迫

利用cDNA芯片技術(shù)，Schafleitner等［48］鑒定出6個(gè)DnaJ－like蛋白均受到到水分脅迫的誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，其作用可能是維持干旱脅迫下細(xì)胞內(nèi)蛋白組分的穩(wěn)定性，從而減輕細(xì)胞的損傷。應(yīng)用同樣的方法，Rodrigues等［49］從甘蔗中篩選出3個(gè)DnaJ－like蛋白，對(duì)其中1個(gè)DnaJ－like蛋白基因的表達(dá)進(jìn)行RT－qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該基因在耐旱品種中下調(diào)表達(dá)，而在不耐旱品種中則上調(diào)表達(dá)，這表明不同的基因型背景導(dǎo)致了基因表達(dá)差異，而這種差異可能是適應(yīng)水分脅迫的選擇性表達(dá)策略。桉樹（Eucalyptus camaldulensis）在水分脅迫下的轉(zhuǎn)錄組分析也篩選出的1個(gè)DnaJ－like蛋白，其3個(gè)等位基因的表達(dá)差異極其顯著，個(gè)別等位基因在脅迫下表達(dá)量提高100多倍［50］。Wang等［51］研究發(fā)現(xiàn)，DnaJ－like蛋白基因AtDjB1敲除的擬南芥（atj1－1）具有較高的葡萄糖水平，以致于植物對(duì)ABA敏感性增強(qiáng)，從而提高了植物對(duì)滲透脅迫的抵抗能力。定位于番茄葉綠體的DnaJ－like蛋白（LeCDJ2），異源表達(dá)顯著提高煙草的抗旱能力，并且通過維持PSII D1蛋白的穩(wěn)定來(lái)減輕光抑制［42］。Zhao等［52］研究表明，擬南芥的DnaJ蛋白的原核表達(dá)能夠提高細(xì)菌對(duì)鹽的耐受性，DnaJ可能在鹽脅迫條件下參與了蛋白質(zhì)的保護(hù)，改善了細(xì)胞膜膜脂的流動(dòng)性，從而增加了細(xì)菌細(xì)胞的活力。

3.2.3 重金屬脅迫

研究表明，重金屬脅迫抑制分子伴侶輔助的蛋白折疊，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，而DnaJ／Dnak／GrpE分子伴侶系統(tǒng)能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的重折疊［53］。Chai等［54］從蕓豆（Phaseolusvulgaris）中分離出編碼1個(gè)DnaJ－like蛋白的基因——PvSR6，該蛋白在重金屬（Hg、Cd、Cu、Zn和As）脅迫下表達(dá)顯著增強(qiáng)。Venkatachalam等［55］在重金屬富集植物田菁（Sesbaniadrummondii）鑒定出1個(gè)Hg2＋誘導(dǎo)的DnaJ－like蛋白。Zhen等［56］通過對(duì)耐鋁大豆種質(zhì)的2－DE蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了3個(gè)DnaJ－like蛋白受鋁誘導(dǎo)而強(qiáng)烈表達(dá)，其中有2個(gè)蛋白是被新誘導(dǎo)表達(dá)，另1個(gè)蛋白在鋁脅迫24、48h和72h的表達(dá)量分別是對(duì)照的3.75、11.45和9.07倍。Cancado等［57］通過cDNA array方法分離鋁脅迫下玉米根系的基因表達(dá)差異，也發(fā)現(xiàn)了1個(gè)在鋁抗性及敏感玉米中差異表達(dá)的DnaJ－like蛋白。Goodwin等［58］也從擬南芥中分離出1個(gè)鋁脅迫下差異表達(dá)的DnaJ－like蛋白，其表達(dá)量是對(duì)照的2.76倍。Duressa等［59］研究發(fā)現(xiàn)鋁抗性大豆（PI 416937）中1個(gè)DnaJ－like蛋白，其在鋁處理48h和72h后分別上調(diào)表達(dá)5.32倍和6.45倍。由此可見，DnaJ－like蛋白能夠響應(yīng)重金屬離子脅迫，可能參與了毒性的解除，但具體的功能和機(jī)制尚不明確。

4 小結(jié)與展望

植物在生長(zhǎng)發(fā)育的過程中不可避免地遭受多種多樣環(huán)境因子的脅迫，為了適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境，植物需要適時(shí)地作出應(yīng)激反應(yīng)。植物可以在多個(gè)層次上、通過不同的途徑及機(jī)制響應(yīng)生物及非生物脅迫。大量研究表明，分子伴侶參與植物的脅迫應(yīng)答，DnaJ－like蛋白在植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及脅迫響應(yīng)過程中具有關(guān)鍵的作用，但是大多數(shù)DnaJ蛋白的功能尚不清楚。由于DnaJ－like蛋白種類及功能的多樣性，且具有不同的亞細(xì)胞定位，DnaJ－like蛋白既可以正調(diào)控植物的防御反應(yīng)，也可以負(fù)調(diào)控植物的防御反應(yīng)，這為認(rèn)識(shí)其作用機(jī)制帶來(lái)了難度。

未來(lái)的研究應(yīng)該從以下幾個(gè)方面進(jìn)行：首先，通過基于轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)篩選脅迫相關(guān)的差異表達(dá)的DnaJ－like蛋白基因，為全面認(rèn)識(shí)其功能奠定基礎(chǔ)；其次，通過功能缺失（loss of function）和功能獲得（gain of function）以及轉(zhuǎn)基因的研究，深入探究DnaJ－like蛋白的功能及分子機(jī)制；最后，篩選關(guān)鍵的靶標(biāo)基因，為植物的抗性遺傳改良提供理論依據(jù)。

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