國產(chǎn)鹽酸特比萘芬對皮膚癬菌的體外抗菌活性研究

談鑫 潘煒華 鄧淑文 郭蕓 雷文知 張超 周兆婧 方文捷 聞軼旸 沈帥帥 朱雙 姚志榮 鄭捷 鄧丹琪 廖萬清

（1.昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院皮膚科，昆明650101；2.上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所上海市醫(yī)學真菌重點分子生物學實驗室，上海200003；3.上海同濟醫(yī)院皮膚科，上海200065；4.上海新華醫(yī)院皮膚科，上海200093；5.上海瑞金醫(yī)院皮膚科，上海200025）

國產(chǎn)鹽酸特比萘芬對皮膚癬菌的體外抗菌活性研究

談鑫1潘煒華2鄧淑文2郭蕓1雷文知2張超2周兆婧2方文捷2聞軼旸3沈帥帥3朱雙2姚志榮4鄭捷5鄧丹琪1廖萬清2

（1.昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院皮膚科，昆明650101；2.上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所上海市醫(yī)學真菌重點分子生物學實驗室，上海200003；3.上海同濟醫(yī)院皮膚科，上海200065；4.上海新華醫(yī)院皮膚科，上海200093；5.上海瑞金醫(yī)院皮膚科，上海200025）

目的 研究探討國產(chǎn)鹽酸特比萘芬對皮膚癬菌的三個屬和角層癬菌的體外抗菌活性。方法 應用美國國家臨床和實驗室標準研究所（CLSI）的M38?A2方案。菌懸液終濃度為（0.4～5）×104CFU／mL，孵育溫度30℃，培養(yǎng)時間7 d。最低抑菌濃度（MIC）的判定標準為，在顯微鏡下觀察，與陽性對照孔對比，100%生長抑制的最低濃度。最低有效濃度（MEC）的判定標準為在顯微鏡下觀察，與陽性生長對照孔比較，50%以上生長抑制。結(jié)果 特比萘芬對138株暗色真菌最低有效濃度（MEC），MEC范圍0.008～0.125 μg／mL，MIC范圍0.008～0.25 μg／mL。國產(chǎn)鹽酸特比萘芬的抗真菌效果與進口特比萘芬的抗真菌效果無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)論 國產(chǎn)鹽酸特比萘芬對皮膚癬菌體外抗菌活性較高，可作為治療淺部真菌病的有效藥物之一。

國產(chǎn)鹽酸特比萘芬；皮膚癬菌；體外；抗菌活性

［Chin J Mycol，2015，10（1）：22?24］

淺部真菌病是由皮膚癬菌、病原酵母菌等致病真菌或條件致病真菌感染人體皮膚、毛發(fā)和甲板等淺表組織而引起的一組疾病。隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素的廣泛應用，以及人員流動、環(huán)境變化，淺部真菌病發(fā)病率呈日益上升的趨勢，嚴重影響人類健康及生活。臨床上，及時明確致病菌種，再根據(jù)藥敏實驗結(jié)果給予有效的抗真菌治療，是淺部真菌病最為合理的診治途徑。目前發(fā)現(xiàn)的可使人類淺部組織感染的致病真菌已逾百種，鹽酸特比萘芬是強效抗真菌藥物，具有強效殺真菌、減少復發(fā)，縮短療程，抗炎、親脂等特點。本課題旨在驗證國產(chǎn)鹽酸鹽酸特比萘芬對不同菌株的體外藥敏性特征，從多中心抽取樣本檢驗其活性。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

共收集上海長征醫(yī)院、上海瑞金醫(yī)院、上海新華醫(yī)院、上海長海醫(yī)院、上海華山醫(yī)院、昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院、新疆醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院等六家醫(yī)院的淺部真菌臨床分離株138株。其中紅色毛癬菌70株（50.7%），其他毛癬菌23株（包括紫色毛癬菌、疣狀毛癬菌、斷發(fā)毛癬菌、西非毛癬菌、指間毛癬菌、許蘭毛癬菌6種，占16.7%），絮狀表皮癬菌5株（3.6%），小孢子菌屬10株 （7.2%），其他菌30株（21.7%）。除直接鏡檢和培養(yǎng)外，所有菌株均采用分子生物學方法，擴增核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)（rDNA ITS）基因序列鑒定到菌種［1］。近平滑念珠菌ATCC 22019為質(zhì)控菌株。

1.2 抗真菌藥

國產(chǎn)鹽酸特比萘芬由保定天浩醫(yī)藥銷售有限公司提供。對照藥為進口鹽酸特比萘芬，購自上海市醫(yī)藥工業(yè)研究院。

本實驗采用美國美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）CLSI?M27A3［2］和M38A2［3］文件所推薦的微量液基稀釋法（Broth Microdilution）配制上述藥物的貯存液及倍比稀釋液。

1.3 菌懸液制備

試驗前所有受試菌均接種在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）上28℃培養(yǎng)7 d使其活化。在孵育7 d的菌落上加入含有0.01 mL吐溫20（1滴）的0.85%鹽水1 mL，制備菌懸液；菌懸液靜置3～5 min后，大顆粒沉于底部，取上層均質(zhì)液體（含孢囊孢子或分生孢子以及菌絲片段）；用血細胞計數(shù)板將菌懸液濃度用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整至2×106～1× 107CFU／mL。最后將上述已經(jīng)配置好的菌懸液用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋1 000倍，使其濃度介于2× 103～1×104CFU／mL之間。

1.4 真菌藥敏試驗

本實驗采用2008年臨床實驗室標準化研究所（CLSI）指南上提出CLSI?M27A3［2］和M38A2［3］文件所推薦的微量液基稀釋法 （Broth Microdilution）檢測待篩選化合物對假絲酵母菌和絲狀真菌最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最低有效濃度 （minimal effective concentration，MEC）。特比萘芬的最終工作濃度為0.008～0.5g／mL，結(jié)果判定在顯微鏡下進行。所有菌株均進行2次重復試驗。每次試驗均包含標準菌株的測定以保證試驗準確。

1.4 MIC和MEC的判定

判讀結(jié)果：30℃靜置培養(yǎng)4～7 d后觀察結(jié)果。

最低抑菌濃度 （MIC）的判定標準：在顯微鏡下觀察，與陽性對照孔對比，完全抑制，無生長的最低濃度。最低有效濃度 （MEC）的判定標準：在顯微鏡下觀察，與陽性生長對照孔比較，50%以上生長抑制。計算所有菌株MIC和MEC的幾何均數(shù)，以及50%和90%的MEC值或MIC值（菌株少于5株不計算幾何均數(shù)。菌株少于3株不計算MEC50和MEC90）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應用StatsDirect v2.7.8（StatsDirect，Cheshire，英國）分析軟件統(tǒng)計。

2 結(jié) 果

所有受試皮膚癬菌菌種在30℃、5～7 d培養(yǎng)后均生長良好，每次試驗各質(zhì)控菌株的MIC值均在參考范圍內(nèi)。采用顯微鏡下判讀藥敏板，MIC、MEC結(jié)果見表1。國產(chǎn)鹽酸特比萘芬對毛癬菌屬的MIC范圍為0.008～0.25 μg／mL，MEC90：0.125 μg／mL，MIC50：0.008 μg／mL，GM：0.034 μg／mL，MEC范圍為 0.008～0.125 μg／mL，MEC90：0.125 μg／mL，MEC50：0.008 μg／mL，GM：0.018 μg／mL。對小孢子菌屬的MIC范圍為0.016～0.25 μg／mL，MIC90：0.25 μg／mL，MIC50：0.125 μg／mL，GM：0.142 μg／mL，MEC范圍為 0.008～0.062 5 μg／mL，MEC90：0.062 5 μg／mL，MEC50：0.016 μg／mL，GM：0.031 4 μg／mL。對表皮癬菌屬的MIC范圍為0.008～0.125 μg／mL，GM：0.037 μg／mL。對其他角層癬菌的MIC范圍為0.062 5～0.25 μg／mL，MIC90：0.25 μg／mL，MIC50：0.125 μg／mL，GM：0.127 μg／mL。

國產(chǎn)鹽酸特比萘芬的抗真菌效果與進口特比萘芬的抗真菌效果無顯著差異（P＞0.05）。

表1 國產(chǎn)鹽酸特比萘芬和進口鹽酸特比萘芬對淺部真菌的MIC范圍及幾何均數(shù)（GM）值（μg／mL）Tab.1 MIC range and geometric mean（GM）value of Beijia terbinafine and imported terbinafine to superficial fungi（μg／mL）

3 討 論

皮膚癬菌的感染僅隱于表皮的角化組織、甲板和毛發(fā)，大多數(shù)不能獨立生存來與其他環(huán)境中的嗜角質(zhì)真菌競爭，需依靠宿主與宿主之間的互相傳播方可生存［4］。目前一般將皮膚癬菌分為3個屬（毛癬菌屬、小孢子菌屬、表皮癬菌屬）及角層癬菌。角層癬菌包括分離自花斑癬、掌黑癬等一些淺部真菌病的真菌。治療常用特比萘芬和三唑類藥物。鹽酸特比萘芬屬于人工合成的一種丙烯胺類化合物，主要抑制角沙烯環(huán)氧化酶，是強有效的真菌殺菌劑，資料顯示該藥對淺部真菌病的良好臨床療效［5］。目前國內(nèi)尚無體外藥敏試驗來支持這一臨床結(jié)果。

我們從上海4家三級醫(yī)院及昆明一家三級醫(yī)院的皮膚科門診收收集皮膚癬菌菌株進行鹽酸特比萘芬體外藥敏試驗，菌株來源可以從一定程度上代表我國東南地區(qū)淺病真菌病的病原菌。研究結(jié)果表明，紅色毛癬菌依然是淺部真菌感染的主要病原菌，占50.7%。除毛癬菌屬、表皮癬菌屬、小孢子菌屬外，其他癬菌也占有相當比例 （21.7%），這些真菌包括太田節(jié)皮菌、萬博節(jié)皮菌、申克氏孢子絲菌、威尼克外瓶霉和毛孢子菌。本組的藥敏結(jié)果顯示，鹽酸特比萘分對皮膚癬菌具有強效殺菌作用，在0.008～0.25 μg／mL范圍均可抑菌。同時，本實驗采用濁度儀測定調(diào)節(jié)待測菌懸液孢子濃度，并與細胞板記數(shù)法確認。藥敏結(jié)果讀板采用顯微鏡下觀察，從客觀上減少了判讀誤差。

國產(chǎn)鹽酸特比萘芬是國產(chǎn)制劑，其價格較進口特比萘芬有一定優(yōu)勢。從試驗結(jié)果看，皮膚癬菌對兩種鹽酸特比萘芬的敏感性無顯著差異，提示保定天浩醫(yī)藥有限公司提供的特比萘芬對皮膚癬菌的抑菌作用明顯，可作為治療淺部真菌病的有效藥物之一。

致謝：本研究得到國家 973項目（2013CB531601，2013CB531606），國家科技重大傳染病專項（2013ZX10004612?001）的資助，同時還得到云南省聯(lián)合專項重點項目（2012FB006）和上海市科委專項（14DZ2272900，12JC141000）對本研究的資助。一并表示衷心感謝。感謝保定天浩制藥有限公司提供本研究所用特比萘芬。 參考文獻

［1］ Altschul XF，Gish W，Miller W，et al.Basic local alignment search tool［J］.J Mol Biol，1990，215（3）：403?410.

［2］ Clinical and Laboratory Standards Institute M27?A3.Clinical and Laboratory Standards Institute／National Committee for Clinical La?boratory Standards：Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of Yeast，Approved Standard［M］.3th ed.Wayne，PA：2009.

［3］ Clinical and Laboratory Standards Institute M38?A2.Clinical and Laboratory Standards Institute／National Committee for Clinical La? boratory Standards：Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of Yeast.Approved Standard［M］3th ed.Wayne，PA：2008.

［4］ Sigurgeirsson B，Baran R.The prevalence of onychomycosis in the global population?A literature study［J］.J Eur Acad Dermatol Ve?nereol，2014，28（11）：1480?91.

［5］ 張成鋒，陳連軍.抗真菌藥在皮膚淺部真菌病治療中的合理應用［J］.上海醫(yī)藥，2005，211（2）：174.

In vitro susceptibility testing of domestic terbinafine hydrochloride against dermatophytes

TAN Xin1，PAN Wei?hua2，DENG Shu?wen2，GUO Yun1，LEI Wen?zhi2，ZHANG Chao2，ZHOU Zhao?jing2，F(xiàn)ANG Wen?jie2，WEN Yi?yang3，SHEN Shuai?shuai3，ZHU Shuang2，YAO Zhi?rong4，ZHENG Jie5，DENG Dan?qi1，LIAO Wan?qing2
（1.Department of Dermatology，The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650101；2.Shanghai Key La?boratory of Molecular Medical Mycology，Shanghai Changzheng Hospital，Shanghai 200003；3.Department of Dermatology，Shanghai Tongji Hospital，Shanghai 200065；4.Department of Dermatology，Shanghai Xinhua Hospital，Shanghai 200093；5.Department of Der?matology，Shanghai Ruijin Hospital，Shanghai 200025）

Objectives To investigate the in vitro susceptibility testing of terbinafine against 138 strains of dermatophytes.Meth?ods CLSI M38?A2 guideline was applied.The media containing the fungi in the concentration of（0.4?5）×104CFU／mL were incuba?ted at 30 for 7 days.The MIC endpoint was determined as the first concentration of antifungal agent that reached 100%inhibition of growth compared with the growth control.The MEC endpoint was determined as the first concentration of antifungal agent that reached 50%inhibition of growth compared with the growth control.Results The tested 138 strains of Dermatophytes were susceptible to ter?binafine，MEC range：0.008?0.125 μg／mL，MIC 0.008?0.25μg／mL.There was no statistical differences between Beijia terbinafine and imported terbinafine（P＞0.05）.Conclusion Beija Terbinafine is active aganist Dermatophytes.It can be an effective choice in super?ficial mycosis treatment.

domestic terbinafine hydrochloride；dermatophytes；in vitro；antifungal susceptibility tests

R 978.5

A

1673?3827（2015）10?0022?03

2014?10?21

［本文編輯］ 王 飛

國家自然科學基金（31270180），上海醫(yī)學真菌分子重點實驗室基金（14DZ2272900）

談鑫，男（漢族），碩士，住院醫(yī)師.E?mail：aids141＠126.com；潘煒華，女（漢族），博士，副主任醫(yī)師.E?mail：panweihua＠m(xù)ed?mail.com.cn

廖萬清，E?mail：liaowanqing＠sohu.com；鄧丹琪，E?mail：danqid128＠sina.com