鹽堿脅迫下玄參幼苗的抗性生理響應(yīng)研究Δ

付英杰，曲曉歡，李艷芝，王建安（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東日照276826）

玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensisHemsl.的塊根，主要成分為環(huán)烯醚萜苷類、揮發(fā)油、甾醇、多糖等成分，具有清熱涼血、瀉火解毒等功效，為傳統(tǒng)“浙八味”中藥之一[1]。玄參喜溫暖濕潤(rùn)氣候，耐寒，對(duì)土壤品質(zhì)要求較低，通常選擇肥沃、排水良好的砂質(zhì)壤土及富含腐殖質(zhì)的土壤栽培；原產(chǎn)于浙江筧橋，現(xiàn)多為栽培品，主產(chǎn)于浙江、山東、陜西[2]。筆者在黃河三角洲考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，玄參能夠在鹽堿地中生存，因此考慮玄參有可能成為鹽堿地新栽培藥用品種。目前我國擁有6.7×106hm2的次生鹽堿地，并且還存在約有1.7×107hm2的潛在鹽堿土[3]，其開發(fā)利用受到高度重視。目前治理鹽堿地較有優(yōu)勢(shì)的方法是種植耐鹽植物，可抑制土壤返鹽，增加土壤有機(jī)質(zhì)以改善土壤結(jié)構(gòu)。而種植耐鹽植物首先要考察植物耐鹽生理，其次對(duì)植物耐鹽能力的提高進(jìn)行研究[4]，從而確定該植物的耐鹽堿特性，并能夠初步探究其耐鹽堿機(jī)制。

目前玄參栽培方面的研究多集中在肥料種類、施肥技術(shù)、管理技術(shù)、栽培類型及遺傳性等[5-6]，而尚未見在鹽堿化土壤中種植玄參的研究性文獻(xiàn)。因此，筆者擬通過對(duì)鹽堿脅迫下玄參幼苗的生長(zhǎng)指標(biāo)及抗性生理響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，以探討抗氧化防御和滲透調(diào)節(jié)機(jī)制在玄參幼苗對(duì)鹽堿脅迫適應(yīng)中的作用。

1 材料

1.1 儀器

UV-2450型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；LD4-2A型低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；HWSY11-K2C型恒溫水浴鍋（北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）；DL-PNT3000土壤鹽堿度（活度）檢測(cè)儀（德國STEPS公司）；DDL-9604型電導(dǎo)率儀（北京格樂普高新技術(shù)有限公司）。

1.2 幼苗與試劑

玄參幼苗產(chǎn)自浙江省磐安縣；硫酸鈦（CP，批號(hào)：20131213，純度：98%）、核黃素（批號(hào)：F20080123，純度：98%）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脯氨酸（Pro，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140677-201308，純度：98%）；2-硫代巴比妥酸（批號(hào)：T108505，純度：98%）、甲硫氨酸（批號(hào)：M104886，純度：99%）、愈創(chuàng)木酚（批號(hào)：G112735，純度：99%）均購自上海晶純生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白、各指標(biāo)測(cè)定試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 幼苗的栽培

取玄參幼苗110株，栽培于塑料花盆（上口徑30 cm，高25 cm，具底盤）中?；A(chǔ)土壤選取砂質(zhì)土（土壤養(yǎng)分測(cè)定為有機(jī)質(zhì)14 g/kg、全氮0.95 g/kg、有效磷17 mg/kg、速效鉀135 mg/kg，土壤肥力為中等稍低）。緩苗期澆水、正常管理，每隔4 d澆灌100 ml含大量元素的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[7]。葉片長(zhǎng)至5片時(shí)，選取10株長(zhǎng)勢(shì)相同的為一組，分別以NaCl、NaHCO3和蒸餾水澆灌（見表1）。每隔4 d澆灌1次，并采用土壤鹽堿度檢測(cè)儀及pH計(jì)測(cè)定土壤平均鹽堿度，使其維持在表1含鹽量（變動(dòng)幅度±10%）、pH（變動(dòng)幅度±0.1）條件，同時(shí)測(cè)定相同濃度下儲(chǔ)備土壤的堿化度。幼苗置于光照培養(yǎng)箱中，控制溫度（20±2）℃，光暗周期13 h/11 h，光照強(qiáng)度2000 lx，培養(yǎng)時(shí)間16 d（表中J1～J5、Y1～Y5為堿、鹽不同濃度，CK為空白對(duì)照，簡(jiǎn)稱對(duì)照）。

2.2 指標(biāo)的測(cè)定

測(cè)定玄參幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)（株高、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量）。參考文獻(xiàn)[8-17]測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性與葉綠素（Chl）、過氧化氫（H2O2）、Pro、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）、丙二醛（MDA）含量，以及膜透性（RMP）。

表1 鹽堿脅迫條件及分組Tab 1 Conditions of saline-alkali stress and grouping

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，棄去最小、最大值后數(shù)據(jù)以±s表示，采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組玄參幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

本研究顯示，隨鹽堿濃度升高，玄參幼苗株高逐漸降低。當(dāng)堿脅迫超過150 mmol/L后，株高出現(xiàn)較大幅度降低；當(dāng)鹽脅迫超過50 mmol/L后，株高開始降低。在堿脅迫超過150 mmol/L、鹽脅迫超過50 mmol/L后，玄參幼苗鮮質(zhì)量明顯降低；在堿脅迫超過150 mmol/L、鹽脅迫超過100 mmol/L后，玄參幼苗干質(zhì)量明顯降低。結(jié)果表明，玄參幼苗具有一定的耐鹽堿性，但兩者抗性有區(qū)別，其耐堿性強(qiáng)于耐鹽性。各組玄參幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見圖1。

圖1 各組玄參幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Fig 1 Determination results of growth indexes of S.ning poensis seedlings in all groups

3.2 各組玄參幼苗Chl含量測(cè)定結(jié)果

非鹽生植物受鹽脅迫后，其光合作用直接受到抑制，Chl解體，且合成受抑制，最終不能通過光合作用來獲取植物生長(zhǎng)所用的能量而導(dǎo)致生長(zhǎng)受抑制；而鹽生植物則不同，一定濃度的鹽反而可以促進(jìn)光合作用，但當(dāng)鹽濃度超過閾值后也會(huì)發(fā)生抑制[18]。本研究顯示，當(dāng)堿脅迫超過150 mmol/L、鹽脅迫超過50 mmol/L時(shí)，玄參幼苗Chl含量減少，葉片顏色黃化。該結(jié)果印證了生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定的結(jié)論，同時(shí)推斷玄參幼苗在低濃度鹽堿脅迫下光合作用反而可能被促進(jìn)。各組玄參幼苗Chl含量測(cè)定結(jié)果見圖2。

圖2 各組玄參幼苗Chl含量測(cè)定結(jié)果Fig 2 Determination results of Chl contents of S.ningpoen sis seedlings in all groups

3.3 各組玄參幼苗酶促抗氧化體系生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

本研究顯示，當(dāng)鹽脅迫為50 mmol/L、堿脅迫為150 mmol/L時(shí)，玄參幼苗SOD、POD活性最強(qiáng)；當(dāng)鹽脅迫為150 mmol/L、堿脅迫為50 mmol/L時(shí)，CAT活性最強(qiáng)；隨鹽堿濃度升高，H2O2、MDA含量逐漸增加；隨鹽堿濃度增加，RMP水平升高，即膜穩(wěn)定性逐漸降低。結(jié)果表明，鹽堿脅迫均造成了細(xì)胞質(zhì)膜的損傷，鹽堿能刺激植物迅速產(chǎn)生抗氧化保護(hù)酶對(duì)抗活性氧。CAT、POD、SOD依次為低、中、高濃度堿脅迫的主要保護(hù)酶，POD、SOD、CAT依次為低、低、中濃度鹽脅迫的主要保護(hù)酶，且鹽脅迫中的H2O2、MDA含量及細(xì)胞質(zhì)膜受損程度明顯高于堿脅迫，因此可以認(rèn)為玄參幼苗的耐堿性較耐鹽性強(qiáng)，這也與Chl測(cè)定結(jié)果相吻合。值得指出的是，盡管在150 mmol/L鹽濃度時(shí)CAT活性較高，植株卻普遍出現(xiàn)萎蔫、黃化、倒伏等現(xiàn)象。綜合考慮，玄參幼苗耐堿性仍強(qiáng)于耐鹽性。各組玄參幼苗酶促抗氧化體系生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見圖3。

3.4 各組玄參幼苗滲透調(diào)節(jié)生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

植物在逆境中，Pro作為蛋白分解產(chǎn)物，具有滲透調(diào)節(jié)、穩(wěn)定大分子、降低氨毒性、作為能量庫等多重作用；SS具有滲透調(diào)節(jié)、作為碳架及能量庫的多重作用，可穩(wěn)定細(xì)胞膜及原生質(zhì)，一般情況下，隨SS累積，植物抗逆性逐漸增加。本研究顯示，當(dāng)鹽堿濃度大于100 mmol/L時(shí)，Pro含量停止累積，但堿濃度下Pro含量明顯高于鹽濃度下；隨鹽堿濃度升高，SP含量逐漸減少；當(dāng)鹽濃度大于100 mmol/L、堿濃度大于150 mmol/L時(shí)，SS量停止積累，但兩脅迫組玄參幼苗SS含量及趨勢(shì)差別不大，推測(cè)玄參幼苗耐堿性強(qiáng)的原因之一是Pro的大量積累起到了緩沖的作用。各組玄參幼苗滲透調(diào)節(jié)生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見圖4。

4 討論

在鹽堿條件下，植物一般可通過滲透調(diào)節(jié)、抗氧化能力的提升、營(yíng)養(yǎng)元素平衡、改變代謝類型、維護(hù)膜的完整性等方法來減輕傷害，其中前2種方法存在于大多數(shù)耐鹽堿植物中：（1）滲透調(diào)節(jié)，如可溶性糖、脯氨酸、甜菜堿、無機(jī)離子、逆境蛋白等物質(zhì)濃度的改變。其中脯氨酸可形成類似親水膠體的聚合物，以維持滲透平衡，并保持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性；而可溶性糖則能在細(xì)胞中積累以維持細(xì)胞膨壓；逆境蛋白如胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA蛋白）的產(chǎn)生是水分脅迫的一種保護(hù)反應(yīng)；（2）抗氧化物質(zhì)及抗氧化酶的產(chǎn)生。由于鹽堿脅迫時(shí)植物體產(chǎn)生的大量活性氧極易造成組織氧化損傷，因此植物自身能夠產(chǎn)生清除活性氧的酶和抗氧化物。抗氧化酶主要包括CAT、POD、SOD、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽過氧化物酶（GP）等[19]。同時(shí)，鹽堿脅迫會(huì)引起植物的水分紊亂、生長(zhǎng)限制、氣孔關(guān)閉、CO2固化率降低等[20]。這些植物生長(zhǎng)的促進(jìn)或抑制，與光合作用直接相關(guān)，如對(duì)光能吸收與轉(zhuǎn)化的影響和對(duì)光合電子傳遞、碳同化的影響，因此，葉綠素含量變化也間接反映了植物的抗逆性。

圖3 各組玄參幼苗酶促抗氧化體系生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Fig 3 Determination results of physiological indexes of enzymatic antioxidative systems of S.ningpoensis seedlings in all groups

圖4 各組玄參幼苗滲透調(diào)節(jié)生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Fig 4 Determination results of physiological indexes of osmotic regulation of S.ningpoensis seedlings in all groups

本研究結(jié)果表明，鹽、堿脅迫對(duì)玄參幼苗的生長(zhǎng)有不同程度的影響，一定濃度范圍中其幼苗的株高、干質(zhì)量及鮮質(zhì)量均有不同程度的下降，并伴隨著細(xì)胞質(zhì)膜透性的降低以及MDA、H2O2的產(chǎn)生，其結(jié)果證明了一定濃度的鹽、堿對(duì)玄參幼苗的細(xì)胞具有毒害作用。在此環(huán)境下，玄參幼苗通過改變SOD、CAT、POD等保護(hù)酶活性而清除活性氧，以及增加Pro及SS等滲透調(diào)節(jié)劑的途徑來保持抗?jié)B透脅迫能力，從而減少傷害。值得提出的是，一般鹽堿脅迫情況下，植物光合作用通常下降，但本文發(fā)現(xiàn)玄參幼苗在一定濃度的堿脅迫下反而出現(xiàn)了光合作用增強(qiáng)的現(xiàn)象，可能與堿抗性有一定關(guān)系，有待深入研究。

通過研究，筆者還發(fā)現(xiàn)玄參幼苗對(duì)鹽、堿的脅迫具有不同程度的耐性：可耐受相當(dāng)于150 mmol/L NaHCO3濃度（pH≈8.3）的堿化土壤或50 mmol/L NaCl濃度（含鹽量≈0.35%）的鹽化土壤。因此在今后的推廣種植中，可以適當(dāng)考慮選擇中堿度或低鹽度的土壤。這為今后其他中藥的種植及開發(fā)適合鹽堿地種植的中藥品種提供了相應(yīng)的理論依據(jù)。

本研究旨在考察玄參對(duì)鹽堿的抗性，為耐鹽堿玄參品種選育研究提供參考，因此選用幼苗作為研究對(duì)象。而成熟玄參的有效物質(zhì)含量，留作下一步考察研究。

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