順鉑與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對小鼠宮頸癌組織中Bcl-2、Bax、Caspase-9 表達(dá)的影響

黃彤輝

（南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南 衡陽 421001）

聯(lián)合化療可顯著提高單個(gè)化療藥物的抗腫瘤效力，同時(shí)可明顯減輕化療藥物的毒性反應(yīng)。紫杉烷類與鉑類之間存在交互作用，其合并效應(yīng)呈現(xiàn)出不同程度的相加。目前，順鉑（DDP）和紫杉醇（TXL）聯(lián)合化療已成為治療宮頸癌常用的化療方案。小劑量DDP和TXL聯(lián)合化療方案的抗癌作用與腫瘤細(xì)胞凋亡是否有關(guān)未見相關(guān)報(bào)道。以往研究顯示，DDP和TXL聯(lián)合化療對小鼠宮頸癌細(xì)胞有促凋亡作用，但其相關(guān)機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究觀察了DDP聯(lián)合TXL化療對小鼠宮頸癌細(xì)胞Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶9（Caspase-9）表達(dá)的影響，進(jìn)一步討論DDP、TXL聯(lián)合化療對小鼠宮頸癌細(xì)胞促凋亡作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠宮頸癌U14細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)用615小鼠32只，雌性13只，雄性19只;18～22 g，4～6周;DDP每支 10 mg、TXL每支30 mg;小鼠Bcl-2、Bax單克隆抗體及兔 Caspase-9多克隆抗體。

1.2 模型制備及順鉑、紫杉醇干預(yù) 每只小鼠右腋窩皮下接種0.1 mL（1×106個(gè)宮頸癌U14細(xì)胞），接種10 d后，可捫及皮下結(jié)節(jié)狀瘤體。當(dāng)小鼠皮下結(jié)節(jié)狀瘤體直徑約6 mm（100 mm3）且無并發(fā)癥即可入選注藥。小鼠隨機(jī)分為A組9只、B組9只、C組10只、D組10只。A組小鼠皮下注射生理鹽水0.2 mL，每6天1次。B組小鼠皮下注射DDP 4 mg/（kg·mL），每6天1次。C組小鼠腹腔注射TXL 50 mg/（kg·mL），每周1次。D組小鼠皮下注射DDP 4 mg/（kg·mL），每6 天1 次;TXL 50 mg/（kg·mL），每周1次;第1次注射時(shí)先注射TXL后注射DDP，其后兩藥序貫用藥。待各組中出現(xiàn)第1只小鼠死亡為治療終止時(shí)間點(diǎn)，處死全部實(shí)驗(yàn)用小鼠，切除完整腫瘤組織，用10%中性甲醛溶液浸泡固定，乙醇梯度脫水后石蠟包埋，常規(guī)切片（4 μm 厚）。

1.3 宮頸癌組織Bcl-2、Bax、Caspase-9檢測 采用免疫組化SP法。用PBS液代替一抗作陰性空白對照。Bcl-2、Bax及Caspase-9一抗工作濃度分別為1∶150、1∶100、1∶100。以 PBS 代替一抗作為空白對照。一抗孵育4℃過夜，鏡下控制染色，Bcl-2、Bax及Caspase-9陽性反應(yīng)均表現(xiàn)為定位于胞膜和胞質(zhì)內(nèi)棕黃色或棕褐色細(xì)小顆粒。每張免疫組化片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，使用免疫組化圖像分析軟件測其積分光密度值并取其平均值，以積分光密度值反映 Bcl-2、Bax、Caspase-9 表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組宮頸癌組織Bcl-2、Bax、Caspase-9表達(dá)比較見表1。

表1 各組宮頸癌組織Bcl-2、Bax、Caspase-9表達(dá)比較（ ± s）

表1 各組宮頸癌組織Bcl-2、Bax、Caspase-9表達(dá)比較（ ± s）

注:與 D 組比較，*P ＜0.05。

組別Bcl-2 Bax Bax/Bcl-2 Caspase-9 A 組 6 300.43 ±458.34* 7 244.22±363.72* 1.14 ±0.31* 5 144.22 ±363.71*B 組 4 146.56 ±202.50* 6 613.89±237.49* 1.59 ±0.22* 6 913.89 ±337.49*C 組 5 361.20 ±367.80* 6 210.50±320.25* 1.15 ±0.31* 9 310.50 ±220.25*D 組 1 950.80 ±103.31 9 334.40±471.53 4.79 ±1.34 10334.40 ±351.53

3 討論

聯(lián)合、間隙、持續(xù)化療為目前惡性腫瘤主要的抗癌方案。2014年FIGO指南指出，DDP和TXL聯(lián)合化療為宮頸癌的常用化療方案［1］。目前研究認(rèn)為，TXL通過結(jié)合到微管蛋白上，從而促進(jìn)微管蛋白的聚合。DDP于1978年首先在美國批準(zhǔn)于臨床應(yīng)用，為第一代鉑類抗腫瘤藥物，具有廣譜的抗腫瘤作用，迄今為止是被公認(rèn)為最有效的化療藥物之一，并被推薦用于復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移宮頸癌患者的一線單藥化療，DDP阻礙DNA合成及復(fù)制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長［2］。細(xì)胞凋亡是一種或多種刺激因素誘發(fā)的程序性破壞過程，是由相關(guān)基因介導(dǎo)的細(xì)胞生理死亡方式，它對維持機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的恒定具有重要意義。生理性細(xì)胞凋亡對維持正常的生命活動(dòng)是必需的，而藥物誘導(dǎo)的病理性凋亡同樣具有重要的臨床意義。凋亡誘導(dǎo)產(chǎn)生的Caspase級聯(lián)反應(yīng)有兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑。多數(shù)抗腫瘤藥物即通過內(nèi)源性線粒體途徑發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

Bcl-2家族分為Bal-2和Bax兩大亞族，Bal-2家族中包括Bax、Bak、Bad、Bid和 Bim，通過形成一個(gè)通道啟動(dòng)線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔改變膜對一些離子、小分子或蛋白質(zhì)的通透性而參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Bcl-2為公認(rèn)的Bcl-2家族蛋白成員中主要抗凋亡分子。Bcl-2通過干擾細(xì)胞色素C及Ca2+的釋放，降低核酸內(nèi)切酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞色素C無法達(dá)到激活下游胱冬肽酶的閾值，從而保護(hù)細(xì)胞器功能，抑制細(xì)胞凋亡。而Bax是促凋亡基因，Bax的N端暴露，引起細(xì)胞色素C和各種促凋亡因子的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［3～7］。Bax/Bcl-2的比值決定了細(xì)胞是否凋亡。Caspase-9是天門冬氨酸蛋白酶家族中13種Caspase的主要成員之一，是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白酶，處于凋亡的始動(dòng)階段，一旦被激活，即發(fā)生下游的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［8～11］。Caspase-9主要在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑中活化，從而激活效應(yīng)Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。從陽性信號分布來看，Caspase-9主要位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)，從陽性表達(dá)率來看，Caspase-9在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)率與正常組織無差異。說明Caspase-9在正常組織中的表達(dá)也是一個(gè)經(jīng)常性的事件。但是Caspase-9在抗癌治療過程中表達(dá)量增加可能有助于此腫瘤的治療，Caspase-9的高表達(dá)在促進(jìn)細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要作用［12，13］。本研究顯示，與單用 DDP 或 TXL 相比，DDP聯(lián)合TXL化療可降低Bcl-2水平，增加Bax、Caspase-9表達(dá)及Bax/Bcl-2。

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