原發(fā)性失眠患者血清炎性因子水平、PBMC中NF-κB表達、外周血免疫細胞計數(shù)變化及意義

王志偉，汪青松

（1安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍臨床學(xué)院，合肥 230000;2解放軍第105醫(yī)院）

原發(fā)性失眠是臨床常見睡眠障礙，對個人的生理、心理造成了嚴重的傷害，同時給社會造成巨大的經(jīng)濟及醫(yī)療負擔(dān)［1］。原發(fā)性失眠的發(fā)病機制目前尚不明確，其與機體免疫功能之間的關(guān)系仍知之甚少。大量研究發(fā)現(xiàn)，睡眠缺失可以導(dǎo)致機體內(nèi)免疫機能及炎性反應(yīng)的變化，但是實驗對象主要是健康成年人，而采用睡眠剝奪實驗來模擬日常慢性失眠患者病理生理變化很難完全反映原發(fā)性失眠患者體內(nèi)相應(yīng)的變化［2，3］。2013年9月 ～2014年9月，我們觀察了原發(fā)性失眠患者血清IL-2、IL-6及外周血單個核細胞（PBMC）中核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）和外周血免疫細胞計數(shù)變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 原發(fā)性失眠患者38例（觀察組），男16例，女22例;平均年齡43.76歲，平均受教育年限12 a。納入標準:受試對象年齡18～55歲。均符合美國《精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊》第四版（DSM-IV）失眠的診斷標準，且排除其他情況伴發(fā)的失眠。另選42例健康體檢者（對照組），男20例，女22例;平均年齡42.04歲，平均受教育年限12 a。納入標準:a.沒有對失眠的主訴;b.通常睡眠持續(xù)在7～9 h。排除標準:受試者必須排除下列因素的干擾:a.其他類型的睡眠障礙（如睡眠呼吸暫停綜合征、周期性肢體不寧腿綜合征等）;b.有以下慢性精神性疾病，如抑郁癥、焦慮癥、精神類物質(zhì)依賴等;c.可能會影響睡眠或免疫系統(tǒng)的急性或者慢性疾病（如腫瘤、心腦血管疾病、自體免疫性疾病等）;d.最近2周未服用能影響睡眠結(jié)構(gòu)和免疫功能的藥物（如治療精神類疾病的藥物、降血壓藥物、抗炎癥類藥物等）;e.受孕的婦女。

1.2 血清IL-2、IL-6檢測 采用ELISA法。將所有試劑從冰箱內(nèi)取出，放置于室溫下（18～25℃）并充分混勻，濃縮洗滌液加20倍蒸餾水稀釋，充分混勻。凍干標準品按要求稀釋，用前1 h配制，并充分混勻。IL-2、IL-6測定:分別取出IL-2、IL-6反應(yīng)板加入10 μL 標準品（Standars）、已稀釋血清 1 μL 于相應(yīng)反應(yīng)孔中。每孔分別加入50 μL Anti IL-2 Biotin/50 μL Anti IL-6 Biotin 和 50 μL Anti IL-2 POD/50 μL Anti IL-6 POD，輕輕混勻30 s，封住板孔，室溫溫育45 min。甩盡板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板（每孔內(nèi)加入350 μL洗滌液），并去除水滴（在厚迭吸水紙上拍干），反復(fù)洗滌 5次。再每孔加入100 μL顯色液，輕輕混勻10 s，室溫孵育。最后每孔加入100 μL終止液（Stop Solution）。輕輕混勻30 s;30 min內(nèi)在450 nm處讀取OD值。以O(shè)D值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。根據(jù)血清樣品的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

1.3 單核細胞分離、核蛋白提取及NF-κB檢測無菌條件下，抽取正常對照組和原發(fā)性失眠患者肘靜脈血5 mL，均為空腹狀態(tài)，置于肝素抗凝管中，輕輕混勻，立即進行下述實驗。用等體積的 PBS（pH7.4）緩沖液稀釋抗凝管中的血液，立即進行分離，充分混勻。室溫下，將4 mL淋巴細胞分離液加入15 mL離心管，再將上述稀釋的血液沿離心管壁緩緩平鋪在淋巴細胞分離液面上層，使二液間界限分明。室溫下以1 500 r/min離心15 min，吸取血漿和分離交接面白色云霧狀單個核細胞層于另一15 mL無菌離心管中，得到的單個核細胞以5倍體積PBS液稀釋，并充分混勻，室溫下以1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，輕輕彈起細胞沉淀，盡量去掉上清液，底層為單個核細胞。再用500 μL低滲緩沖液吹打細胞，移入預(yù)冷離心管，冰上孵育15 min，加25 μL 洗滌劑，高速振蕩 10 s，低溫微型離心機4℃ 30 s，將上清（細胞漿碎片）保存?zhèn)溆谩?0 μL完全裂解緩沖液內(nèi)重懸細胞，高速振蕩10 s，搖床，150 r/min，冰上孵育30 min，高速振蕩30 s，低溫微型離心機4℃、10 min，上清（核碎片）-80℃保存?zhèn)溆?。核提取物蛋白濃度用Bradford法測定。按照試劑盒提供的說明書，按ELISA法檢測NF-κB。

1.4 外周血免疫細胞計數(shù) 釆用Sysmex2100血細胞分析儀對采血當日的標本進行白細胞計數(shù)，操作按照說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。采用Spearman相關(guān)分析法分析血清 IL-2、IL-6水平及PBMC中NF-κB的相關(guān)性。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血清 IL-2、IL-6水平及 PBMC中NF-κB表達比較 結(jié)果見表1。

表1 兩組患者血清IL-2、IL-6水平及PBMC中NF-κB 表達比較（ ±s）

表1 兩組患者血清IL-2、IL-6水平及PBMC中NF-κB 表達比較（ ±s）

注:與對照組比較，*P ＜0.05。

組別 n IL-2（ng/mL） IL-6（pg/mL）NF-κB（ng/mL）觀察組 38 97.78 ±30.61* 6.05 ±2.01* 9.06 ±5.74*對照組42 77.82 ±35.85 4.45 ±2.18 4.21 ±2.29

2.2 觀察組血清IL-2、IL-6水平及PBMC中NF-κB表達的相關(guān)性 觀察組血清IL-2水平與IL-6水平呈正相關(guān)（r=0.529，P＜0.05），IL-2 水平與 NF-κB水平呈正相關(guān)（r=0.631，P＜0.05），IL-6 水平與NF-κB 水平呈正相關(guān)（r=0.809，P＜0.05）。

2.3 兩組外周血白細胞、淋巴細胞、單核細胞計數(shù)比較 結(jié)果見表2。

表2 兩組外周血白細胞、淋巴細胞、單核細胞計數(shù)比較（×109/L，±s）

表2 兩組外周血白細胞、淋巴細胞、單核細胞計數(shù)比較（×109/L，±s）

注:與對照組比較，*P ＜0.05。

組別 n 白細胞 淋巴細胞 單核細胞觀察組 38 7.01 ±3.43* 5.17 ±0.54* 0.60 ±0.21*對照組42 5.11 ±1.28 4.92 ±0.42 0.44 ±0.21

3 討論

原發(fā)性失眠是臨床上一種很常見的睡眠障礙。美國《精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊》第4版（DSM-IV）關(guān)于原發(fā)性失眠的診斷標準為睡眠啟動困難和（或）睡眠維持困難或醒后體力、精力難以恢復(fù)，至少在1個月以上，引起社交及工作上的的苦惱，同時伴有工作及相關(guān)其他重要功能的損害;并排除以下疾病如慢性疼痛、慢性疾病、藥物或物質(zhì)依賴等引起的失眠。到目前為止，原發(fā)性失眠是臨床上常見的睡眠障礙。慢性失眠的最主要的特征是睡眠啟動及睡眠維持困難，以及睡眠對身體功能恢復(fù)作用的缺失。原發(fā)性失眠是很難治愈的一種疾病，目前我們對于失眠的臨床機制及神經(jīng)生物學(xué)方面的了解非常局限。有報道［4］顯示，慢性失眠與下丘腦—垂體—腎上腺的節(jié)律性激活有關(guān)，并且失眠的嚴重性與下丘腦—垂體—腎上腺軸激活程度呈現(xiàn)正相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組血清IL-2水平高于對照組，提示失眠可以影響IL-2水平。其釋放機制可能是原發(fā)性失眠神經(jīng)系統(tǒng)去甲腎上腺素軸活性被激活后，腎上腺素釋放因子導(dǎo)致了IL的分泌［5］?；罨腘K細胞、單核細胞及淋巴細胞可以分泌IL，IL-2與不同的受體結(jié)合，產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)不盡相同［6］。IL-2主要生理功能是促進炎癥細胞的增殖反應(yīng)，對炎癥反應(yīng)起到非常重要的作用［7］。研究［8］表明，給實驗性兔藍斑注射外源性IL-2，可以導(dǎo)致非快速眼動時程的延長，因此推斷外源性IL-2對睡眠起到重要的調(diào)節(jié)作用。研究［9］發(fā)現(xiàn)，在夜間睡眠紊亂的情況下，IL-6較基礎(chǔ)水平明顯上升。除了慢性失眠，急性及慢性睡眠剝奪、慢性病痛、心理應(yīng)激等同樣可以導(dǎo)致IL-6分泌水平的增高［10］。體內(nèi)單核細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞可以分泌 IL-6，但主要由單核細胞分泌［11］。所以在探索睡眠及睡眠障礙相關(guān)疾病時，主要通過測量單核細胞分泌IL-6水平的改變。文獻［12］報道，睡眠質(zhì)量越差、睡眠時間越少，血清中IL-6水平越高。表明慢性睡眠缺失與IL-6水平密切相關(guān)。IL-2及IL-6作為細胞因子在免疫途徑中起到至關(guān)重要的作用，同時，對睡眠的調(diào)節(jié)也起到非常重要的調(diào)節(jié)作用，相反睡眠的深度、時相也對其分泌產(chǎn)生重要的影響［13］。慢性失眠會導(dǎo)致人體慢性炎性反應(yīng)及全身免疫功能的變化［14］。進一步提醒我們，IL-2及IL-6作為具有多種功能活性的炎癥因子，通過其分泌水平的改變進而參與失眠對機體的調(diào)節(jié)。因而，對IL-2、IL-6與失眠患者之間更加深入的調(diào)節(jié)機制，對改善失眠患者的睡眠效率、質(zhì)量及健康有著重要的研究價值。

本研究還發(fā)現(xiàn)，觀察組PBMC中NF-κB水平高于對照組，且與血清IL-2、IL-6水平呈正相關(guān)。本實驗觀察到睡眠缺失導(dǎo)致細胞內(nèi)NF-κB水平升高，證實了先前生物信息學(xué)的發(fā)現(xiàn)［15］，同時使人們了解到睡眠缺失是通過什么分子機制導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生。研究［16］發(fā)現(xiàn)，急性精神應(yīng)激導(dǎo)致去甲腎上腺素水平增高，去甲腎上腺素導(dǎo)致體內(nèi)炎癥標志物釋放而進入血液中，同時也導(dǎo)致NF-κB的激活。同時有研究表明，生理上正常的去甲腎上腺素水平在體內(nèi)能導(dǎo)致NF-κB 依賴性的活性激活［17］。

本實驗通過觀察長期慢性原發(fā)性失眠較睡眠正常健康人群對各種炎癥指標及功能性白細胞的影響，因為日常生活中，原發(fā)性失眠遠多于繼發(fā)性失眠，所以我們只研究原發(fā)性失眠對免疫功能的影響。幾乎所有的細胞學(xué)指標均有統(tǒng)計學(xué)上的改變。本研究顯示，觀察組白細胞、淋巴細胞、單核細胞計數(shù)高于對照組。說明了持續(xù)的、長久的睡眠抑制可能激活了人體的非特異性的免疫防御反應(yīng)。因此，這些免疫細胞的增加，可能是由于長期的覺醒或者自我平衡睡眠驅(qū)動能力的增強，導(dǎo)致了免疫系統(tǒng)的激活，同時這可能是對免疫系統(tǒng)功能維持的一種適應(yīng)性機制［18］。

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