腹腔內(nèi)注射脂多糖對(duì)大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響及炎性因子變化

白麗娟 任 艷 羅曉光 姜 新 陳曉虹

(1.遼寧省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽110016;2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽110001)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要病理變化表現(xiàn)為黑質(zhì)內(nèi)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元選擇性丟失，紋狀體中的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺和乙酰膽堿之間的相互拮抗作用失調(diào)而導(dǎo)致。自1988年，McGeer等［1］在帕金森病患者中的中腦黑質(zhì)致密帶(pars compacta of substantia nigra，SNpc)中發(fā)現(xiàn)了激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，從此開始，以小膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征的神經(jīng)免疫炎性反應(yīng)機(jī)制受到關(guān)注。

免疫系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)之間存在雙向信息交流，尤其在腦內(nèi)存在廣泛的神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞信息網(wǎng)絡(luò)［2］。小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦組織中固有的免疫效應(yīng)細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)受損時(shí)，可從靜止變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，有助于宿主防御和修復(fù)［3］;但當(dāng)機(jī)體受到外周免疫刺激時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞的改變與神經(jīng)元的關(guān)系卻有待進(jìn)一步研究。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁組成成分，在免疫應(yīng)答研究中常被作為一種多克隆免疫激發(fā)劑來模擬機(jī)體免疫激發(fā)狀態(tài)。LPS是小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性強(qiáng)激活劑，只在小膠質(zhì)細(xì)胞存在的情況下才對(duì)多巴胺能神經(jīng)元有毒性作用。本實(shí)驗(yàn)單次給不同年齡的斯普雷格-道利(Sprague-Dawley，SD)大鼠腹腔注射LPS，利用免疫組織化學(xué)方法觀察小膠質(zhì)細(xì)胞和多巴胺能神經(jīng)元在黑質(zhì)的變化及炎性因子的變化，并比較老齡對(duì)其變化的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

取健康SD雄性大鼠，共216只，中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部門提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(遼):72013-0001。分為實(shí)驗(yàn)青年組及老年組，對(duì)照青年組及老年組4組。實(shí)驗(yàn)青年組70只，為雄性2月齡(體質(zhì)量250～350 g);實(shí)驗(yàn)老年組70只，為雄性12月齡(體質(zhì)量450～600 g);對(duì)照組中，青、老年鼠各38只。

各組又根據(jù)腹腔注射LPS或腹腔注射0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液后大鼠處死的不同時(shí)間點(diǎn)采用數(shù)字表法隨機(jī)分為5個(gè)亞組:即6 h，12 h，24 h，48 h及1周亞組。其中，實(shí)驗(yàn)青年組和實(shí)驗(yàn)老年組各有40只接受免疫組織化學(xué)染色，另外30只接受酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測;對(duì)照青年組和對(duì)照老年組各有8只接受免疫組織化學(xué)染色，另外30只接受ELISA檢測。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)組均給予腹腔注射LPS 1 mg/kg，對(duì)照組均給予腹腔注射0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液1 mg/kg。

多巴胺能神經(jīng)元及活化小膠質(zhì)細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色變化的觀察:各組大鼠分別于給藥后6 h、12 h、24 h、48 h及1周時(shí)進(jìn)行心臟灌流、取腦，石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，于顯微鏡下(100×)觀察多巴胺能神經(jīng)元抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)的變化，于顯微鏡下(400×)觀察活化小膠質(zhì)細(xì)胞抗鈣離子結(jié)合蛋白1(ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba-1)染色效果。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取3張切片，計(jì)算每視野下多巴胺能神經(jīng)元及活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目。

血漿及腦脊液標(biāo)本收集及相應(yīng)標(biāo)本腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素 6(interleukin 6，IL-6)及白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)水平的測定:以10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛(即10 g水合氯醛+100 mL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液)麻醉大鼠。將大鼠頭部固定與身體成大約135°角，在枕骨嵴下凹陷處進(jìn)針大約0.5 cm抵達(dá)小腦延髓池，緩慢抽取腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)?？焖贁囝^殺鼠，用置于冰上乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)化的試管收集小鼠血漿。ELISA法測定腦脊液標(biāo)本及血標(biāo)本中TNF-α、IL-6及IL-1β濃度，計(jì)算出相應(yīng)的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 15.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行析因方差分析法，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 多巴胺能神經(jīng)元(TH染色陽性細(xì)胞)計(jì)數(shù)

腹腔注射脂多糖12 h后，實(shí)驗(yàn)老年組多巴胺能神經(jīng)元開始明顯減少(P＜0.05)，而實(shí)驗(yàn)青年組于24 h后出現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目明顯減少(P＜0.05)，即實(shí)驗(yàn)老年組多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目減少早于實(shí)驗(yàn)青年組;12 h后各時(shí)間點(diǎn)老年組多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量均少于青年組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，詳見圖1。

圖1 多巴胺能神經(jīng)元(TH染色陽性細(xì)胞)數(shù)目的定量分析Fig.1 Quantitative analysis of dopaminergic neurons(TH positive cells)

2.2 活化小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1染色陽性細(xì)胞)計(jì)數(shù)

實(shí)驗(yàn)老年組與實(shí)驗(yàn)青年組大鼠活化小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量高峰均在24 h，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)老年組活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量多于實(shí)驗(yàn)青年組，但是僅在6 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，詳見圖 2。

2.3 多巴胺能神經(jīng)元(TH染色陽性細(xì)胞)形態(tài)學(xué)變化

腹腔注射LPS后，實(shí)驗(yàn)青年組與實(shí)驗(yàn)老年組大鼠黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元胞體變小，密度減小，1周時(shí)最明顯;在相同時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)老年組比實(shí)驗(yàn)青年組大鼠多巴胺能神經(jīng)元胞體變化更為顯著(圖3)。

圖2 活化小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1染色陽性細(xì)胞)數(shù)目的定量分析Fig.2 Quantitative analysis of activiated microglia(Iba-1 positive cells)

圖3 多巴胺能神經(jīng)元免疫組化染色情況Fig.3 Immunohistochemical staining of dopaminergic neurons(100×)

2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1染色陽性細(xì)胞)形態(tài)學(xué)變化

實(shí)驗(yàn)青年組大鼠黑質(zhì)Iba1染色陽性細(xì)胞在12 h及以前呈現(xiàn)為分枝狀，細(xì)胞體小，突起細(xì)長，提示處在“靜止期”;24 h以后表現(xiàn)為桿狀、粗大分枝狀或胞體呈串珠、球狀改變，胞體變大，突觸縮短，且數(shù)量明顯增多，且這種改變以24 h最明顯;1周時(shí)Iba1染色陽性細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)為“靜止期”狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)老年組大鼠黑質(zhì)Iba1染色陽性細(xì)胞數(shù)量變化與青年實(shí)驗(yàn)組大致相同，但出現(xiàn)胞體變大、突觸縮短等形態(tài)學(xué)變化較青年實(shí)驗(yàn)組要早(圖4)。

圖4 小膠質(zhì)細(xì)胞免疫組化染色情況Fig.4 Immunohistochemical staining of microglia(400×)

2.5 血漿中 TNF-α、IL-6和 IL-1β等炎性因子的濃度

實(shí)驗(yàn)老年組和實(shí)驗(yàn)青年組血漿中TNF-α、IL-6和IL-1β濃度隨時(shí)間延長而逐漸下降，其中12 h下降趨勢更明顯，之后趨于平穩(wěn);而且在6 h、12 h、24 h及48 h實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，然而到達(dá)1周時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血漿中TNF-α、IL-6和IL-1β含量趨于一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);相同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)老年組TNF-α、IL-6和IL-1β含量均略高于實(shí)驗(yàn)青年組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖5～7)。

圖5 血漿中TNF-α濃度的定量分析Fig.5 Quantitative analysis of TNF-α in blood plasma

圖6 血漿中IL-6濃度的定量分析Fig.6 Quantitative analysis of IL-6 in blood plasma

圖7 血漿中IL-1β濃度的定量分析Fig.7 Quantitative analysis of IL-1β in blood plasma

2.6 腦脊液中TNF-α 濃度

老年組與青年組相比，老年組TNF-α濃度相對(duì)較高，只有對(duì)照組6 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對(duì)照老年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照老年組6 h相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);對(duì)照青年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照青年組6 h相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)老年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)老年組6 h相比，只有實(shí)驗(yàn)組12 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TNF-α在12 h達(dá)到最高，之后并逐漸下降;實(shí)驗(yàn)青年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)青年組6 h相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，TNF-α在12 h達(dá)到最高，之后并逐漸下降(圖8)。

2.7 腦脊液中IL-6濃度

老年組與青年組相比，老年組IL-6濃度相對(duì)較高，只有對(duì)照組6 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;對(duì)照老年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照老年組6 h相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);對(duì)照青年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照青年組6 h相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)老年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)老年組6 h相比，只有實(shí)驗(yàn)組12 h有差異，其余組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，IL-6在12 h達(dá)到最高，之后并逐漸下降;實(shí)驗(yàn)青年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)青年組6 h相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，IL-6在12 h達(dá)到最高，之后并逐漸下降;實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖9)。

圖8 腦脊液中TNF-α濃度的定量分析Fig.8 Quantitative analysis of TNF-α in cerebrospinal fluid(CSF)

圖9 腦脊液中IL-6濃度的定量分析Fig.9 Quantitative analysis of IL-6 in cerebrospinal fluid

2.8 腦脊液中IL-1β濃度

老年組與青年組相比，老年組IL-1β濃度相對(duì)較高，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對(duì)照老年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照老年組6 h相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);對(duì)照青年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照青年組6 h相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)老年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)老年組6 h相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，IL-1β在12 h達(dá)到最高，之后并逐漸下降;實(shí)驗(yàn)青年組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)青年組6 h相比，只有實(shí)驗(yàn)組12 h有差異(P＞0.05)，其余組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IL-1β在12 h達(dá)到最高，之后并逐漸下降(圖10)。

圖10 腦脊液中IL-1β濃度的定量分析Fig.10 Quantitative analysis of IL-1β in cerebrospinal fluid(CSF)

3 討論

中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元進(jìn)行性選擇性丟失是帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的主要病理特點(diǎn)，涉及氧化應(yīng)激、異常蛋白、神經(jīng)毒性作用、凋亡機(jī)制和線粒體功能異常等分子和細(xì)胞機(jī)制［4］。隨著對(duì)PD患者和動(dòng)物模型研究的深入，人們認(rèn)識(shí)到腦內(nèi)炎性反應(yīng)可能參與了PD的發(fā)病過程。1988年有報(bào)道指出，PD患者腦內(nèi)黑質(zhì)部位檢測到大量主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞［5］，提出炎性反應(yīng)可能參與PD的發(fā)病過程。隨后，更多的研究發(fā)現(xiàn)PD患者黑質(zhì)、紋狀體或腦脊液內(nèi)各種促炎性因子的水平明顯升高，如1L-1β、IL-6等。

小膠質(zhì)細(xì)胞在正常腦組織發(fā)揮重要的免疫監(jiān)視作用。正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，其胞體圓且小，突起細(xì)長，分支少;輕度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大變長，突起增粗，分支增多;高度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞呈阿米巴樣，胞體更大，突起更粗、更短，甚至消失。小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后一方面能夠分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗炎因子如IL-1β等，具有吞噬清除變性死亡神經(jīng)元的“看家”功能;但其異常激活則表現(xiàn)為損傷效應(yīng)，釋放前炎性反應(yīng)因子、活性氧、蛋白酶類和補(bǔ)體蛋白等細(xì)胞毒性分子，亦可釋放多種致炎性細(xì)胞因子，如誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶、TNF-α、IL-1β、T細(xì)胞激活相關(guān)細(xì)胞因子等［6］，從而引起不同程度的免疫炎性反應(yīng)，導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性、壞死。多巴胺能神經(jīng)元對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的有害效應(yīng)具有先天的敏感性。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞并不是簡單的“反應(yīng)性增生”，而是在LPS等刺激因素的作用下在短時(shí)間呈爆發(fā)式釋放［7］，激發(fā)炎性反應(yīng)，產(chǎn)生大量的神經(jīng)毒性物質(zhì)從而啟動(dòng)多巴胺能神經(jīng)元的損傷反應(yīng)。有研究［8-9］發(fā)現(xiàn)，中腦黑質(zhì)區(qū)域是大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞較為富集的區(qū)域，對(duì)炎性介導(dǎo)的神經(jīng)變性過程較為敏感，因此小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在帕金森病發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段中，較之其他神經(jīng)變性疾病有更為重要的意義。

TNF-α屬于一種前炎性反應(yīng)因子，具有多效促炎性，在神經(jīng)變性及脫髓鞘過程中起作用［8-10］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，TNF-α主要由小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，可以誘導(dǎo)神經(jīng)元MHC-I表達(dá)上調(diào)，使之易受到MHC-I限制性細(xì)胞毒性T細(xì)胞攻擊。本實(shí)驗(yàn)中，TNF-α濃度增加先于免疫組織化學(xué)法觀察到的黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，進(jìn)一步證實(shí)，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損或炎性反應(yīng)時(shí)，甚至中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的輕微失衡就能引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，由靜止?fàn)顟B(tài)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)［11-13］。而激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌大量的炎性因子，如 TNF-α、IL-6及 IL-1β等，致使神經(jīng)元變性。有研究［14-15］證實(shí)，增生的小膠質(zhì)細(xì)胞可能在某些功能方面存在著不同的亞群，只有特定亞群的小膠質(zhì)細(xì)胞通過TNF-α等參與多巴胺能神經(jīng)元變性、壞死。

本研究中進(jìn)一步證實(shí)腹腔注射LPS后，可誘導(dǎo)黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元減少并激活小膠質(zhì)細(xì)胞，多巴胺能神經(jīng)元的減少隨時(shí)間延長而逐漸明顯，活化小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量在24 h達(dá)到高峰，并且黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化要早于多巴胺能神經(jīng)元減少，尤其老年組大鼠多巴胺能神經(jīng)元減少要先于青年組大鼠，減少的程度也比青年組大鼠明顯。老年組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活程度比青年組大鼠明顯，雖然老年組活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量多于青年組，但是僅在6 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

腹腔注射LPS后，可誘導(dǎo)血漿和腦脊液中TNF-α、IL-6及IL-1β等炎性因子含量增加，血漿中TNF-α、IL-6及IL-1β等炎性因子含量于6 h已出現(xiàn)高峰，并隨時(shí)間延長而逐漸減少，而腦脊液中TNF-α、IL-6及IL-1β等炎性因子含量的高峰出現(xiàn)于12 h，比血漿中出現(xiàn)的晚;實(shí)驗(yàn)老年組與實(shí)驗(yàn)青年組比較，在各時(shí)間點(diǎn)血漿及腦脊液中TNF-α、IL-6及IL-1β等炎性因子含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

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