低溫高壓一氧化碳(CO)干燥法對離體兔心的保護(hù)作用及機(jī)制

郭義龍 張 鐘 周鵬宇 朱 平 黃 帥 鄭少憶

(廣東省心血管病研究所 廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)心血管外科，廣州510080)

心臟移植作為終末期心力衰竭的有效治療手段近 年來在全世界范圍內(nèi)得到迅速的推廣和發(fā)展。但供心短缺及供心保存時間有限嚴(yán)重地制約著心臟移植的發(fā)展。故急需一種簡單、有效的離體心臟保存方法。

日本的研究人員已經(jīng)將低溫干燥及高壓一氧化碳(carbon monoxide，CO)這兩種方法結(jié)合，并應(yīng)用于小鼠離體心臟的保存，獲得保存48 h后成功復(fù)蘇的結(jié)果［1］。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性的將上述保存方法應(yīng)用于大動物(新西蘭兔)離體心臟的保存，通過對比研究傳統(tǒng)組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽濃度(histidine-tryptophan ketoglutarate solution，HTK液)低溫浸泡保存與該方法對離體兔心的保存效果，進(jìn)一步探討低溫高壓CO干燥法的保存效果及機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

成年新西蘭兔72只(體質(zhì)量2.0～2.5 kg)，雌雄不限(南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號:44002100002755)。采用數(shù)字表法隨機(jī)分為5組:空白對照組8只、即刻移植組16只、普通干燥組16只、高壓干燥CO保存組16只、低溫HTK浸泡組16只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 離體兔心的獲取與保存

從后4組中每組任意取8只作為心臟供體，而剩下的8只作為心臟受體;供體兔分別用3%戊巴比妥鈉由耳緣靜脈注入麻醉(0.75 mL/kg)，并由耳緣靜脈注入稀釋后的肝素鈉溶液抗凝(25 u/mL、5 mL/kg);胸部正中開胸，用4℃的高鉀停跳液［配方:0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉溶液500 mL、10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鉀溶液35 mL、25%質(zhì)量分?jǐn)?shù)硫酸鎂溶液19.2 mL、2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)利多卡因溶液10 mL;灌注壓力為:55.15 mmHg;1 mmHg=0.133 kPa］由主動脈根部灌入使心臟停搏。當(dāng)心臟停搏后心包腔內(nèi)放冰水使心臟均勻降溫。并迅速將心臟取下。

第1組:(空白對照組，GroupⅠ)心臟取出后立即收集血液標(biāo)本及心肌組織標(biāo)本進(jìn)行檢查;第2組:(即刻移植組，GroupⅡ)心臟取出后立即進(jìn)行腹腔異位移植;第3組:(普通干燥組，GroupⅢ)由主動脈根部往離體兔心內(nèi)灌入含有3倍高糖的K-H液10 mL(配方:氯化鈉6.932 g/L、碳酸氫鈉2.1 g/L、氯化鉀0.354 g/L、磷酸氫化鉀0.16 g/L、七水硫酸鎂0.295 g/L、二水氯化鈣0.265 g/L、葡萄糖1.98 g/L)，然后將離體兔心放置在4℃的冰箱內(nèi)保存18 h;第4組:(低溫高壓CO干燥保存組，Group IV)由主動脈根部往離體兔心內(nèi)灌入含有3倍高糖的K-H液10 mL，沖出冠狀動脈內(nèi)殘留血液，并將心臟放置在4℃高壓CO干燥保存罐中保存18 h(CO=0.8ATA，O2=3.2ATA，ATA:1 個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓)［2］;第5 組:(單純低溫 HTK 浸泡組，Group V)由主動脈根部往離體兔心內(nèi)灌入HTK液10 mL(配方:氯化鈉0.876 6 g/L、氯化鉀0.671 0 g/L、6H2O·硫酸鎂0.813 2 g/L、組氨酸·HCL·H2O 3.773 3 g/L、組氨酸27.928 9 g/L、色氨酸0.408 5 g/L、甘露醇5.465 1 g/L、二水氯化鈣0.002 2 g/L、2-酮戊二酸-氫-鉀0.184 2 g/L，該HTK液由德國克勒化學(xué)制藥廠按照Bretschneider配方生產(chǎn))，沖出冠狀動脈內(nèi)殘留血液，并將心臟放置在4℃的冰箱內(nèi)保存18 h。

1.2.2 兔心腹腔異位移植的方法［3-6］

受體兔分別用3%戊巴比妥鈉由耳緣靜脈注入麻醉(0.75 mL/kg)，并由耳緣靜脈注入稀釋后的肝素鈉溶液抗凝(25 μ/mL、5 mL/kg);受體兔腹部備皮后用I型安爾碘消毒，并由腹部正中開腹，精密游離腹主動脈及下腔靜脈。將供心的主動脈與受體腹主動脈行端-側(cè)吻合，將供心的肺動脈與下腔靜脈行端-側(cè)吻合。將供心的肺靜脈及上、下腔靜脈結(jié)扎。吻合完畢后溫鹽水復(fù)溫(整個過程控制在20 min內(nèi))。

1.2.3 標(biāo)本的采集

供心移植完畢后1 h由供心肺動脈采取血液標(biāo)本1 mL，同時切取少許心尖部心肌組織送檢;

1.3 觀測指標(biāo)

1.3.1 心臟復(fù)跳指標(biāo)

本實(shí)驗(yàn)采用“半定量評分法”判定供心復(fù)跳情況:即通過觸摸、肉眼觀察和顯微鏡觀察來評定恢復(fù)血供后5 min內(nèi)、1 h后這2個時間點(diǎn)供心的跳動情況。評分標(biāo)準(zhǔn):1分:顯微鏡下觀察到的心肌纖維顫動，但觸摸不到心臟跳動;2分:可觸摸到很弱的或局部的心臟跳動;3分:心臟整體跳動但是心跳頻率和強(qiáng)度較低;4分:正常的心臟跳動頻率和強(qiáng)度。3分及4分的供心認(rèn)定為復(fù)跳成功;1分及2分的供心認(rèn)定為復(fù)跳失敗。通過對供心跳動情況的半定量分析，可大致了解不同保存處理方法對供心的保護(hù)效果。

1.3.2 心肌酶指標(biāo)

采用Elisa方法檢測血液標(biāo)本中的肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)等心肌酶;上述心肌酶平時保存在心肌細(xì)胞的細(xì)胞器或胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)心肌細(xì)胞受損，細(xì)胞膜破壞，胞質(zhì)中的游離心肌酶迅速釋放入血，對反映心臟心肌細(xì)胞損傷具有特異性和敏感性。

1.3.3 心肌炎性反應(yīng)因子的測定

采用Western blotting法測定心肌組織中4個炎性反應(yīng)因子:腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα，TNF-α)，白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)，白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)，細(xì)胞間黏附因子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)。

1.3.4 心肌切片蘇木精-伊紅染色(HE染色)

分別取高壓CO干燥組及HTK浸泡組保存了18 h并恢復(fù)血供1 h后的供心組織行HE染色檢查。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。所測各項(xiàng)指標(biāo)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和SNK-q檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)(Fisher確切概率法)比較供心復(fù)跳率指標(biāo)在不同組間的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 供心復(fù)跳率比較

CO高壓干燥保存組及HTK浸泡保存組在恢復(fù)供心血供后5 min及1 h這兩個時間點(diǎn)供心復(fù)跳率方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為1.000、0.569)，詳見表1。

表1 離體兔心恢復(fù)血供后的復(fù)跳率Tab.1 Resuscitation rate of the isolated rabbit heart n(%)

2.2 各組間心肌酶的比較

本實(shí)驗(yàn)用Elisa法測量恢復(fù)灌注后1 h從供心肺動脈端抽出來的血中的心肌酶;各實(shí)驗(yàn)組的心肌酶檢測結(jié)果詳見圖1及表2;CO高壓干燥組與HTK液浸泡組在CK-MB、LDH和CK這3項(xiàng)指標(biāo)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而AST在該兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.249)。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組間心肌酶檢查(Elisa法)結(jié)果的柱狀圖Fig.1 Histogram of different cardiac function enzymes

表2 各實(shí)驗(yàn)組間心肌酶檢查(Elisa法)結(jié)果Tab.2 The measurements(Elisa)of the cardiac function enzyme (±s，n=8)

表2 各實(shí)驗(yàn)組間心肌酶檢查(Elisa法)結(jié)果Tab.2 The measurements(Elisa)of the cardiac function enzyme (±s，n=8)

*P＜0.05 vs groupⅣ;Group I:examination without transplantation or preservation;GroupⅡ:underwent transplantation without preservation;GroupⅢ:preserved with desiccation;GroupⅣ:preserved with desiccation and CO;GroupⅤ:preserved with HTK solution;CK-MB:creatine kinase-MB;AST:glutamic-pyruvic transaminase;LDH:lactic dehydrogenase，CK:creatine kinase.

Item GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣ GroupⅤCK-MB/(ng·L-1) 25.68±1.41 29.63±0.76 89.76±4.24 39.57±1.80 61.27±1.69*AST/(ng·L-1) 21.53±0.93 53.83±1.15 72.17±1.36 34.36±0.67 33.54±0.86 LDH/(ng·L-1) 43.98±6.14 160.08±7.46 429.02±16.08 200.23±11.53 323.11±10.74*CK/(ng·L-1) 155.08±10.73 225.50±9.17 1076.54±75.73 546.75±17.60 693.63±33.13*

2.3 各組間炎性反應(yīng)因子比較

本實(shí)驗(yàn)使用Western blotting法檢測恢復(fù)血供后1 h供心組織中的炎性反應(yīng)因子，檢測結(jié)果見圖2及表3。CO高壓干燥組與HTK液浸泡組在TNF-α、IL-1及IL-17這3項(xiàng)指標(biāo)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而ICAM-1在該兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.998)。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組間心肌炎性因子檢查(Western blotting法)Fig.2 The histogram of different myocardium inflammatory factors

表3 各實(shí)驗(yàn)組間炎性反應(yīng)因子檢查結(jié)果(Western blotting法)Tab.3 The measurements of the myocardium inflammatory factors(Western blotting)(±s，n=8)

表3 各實(shí)驗(yàn)組間炎性反應(yīng)因子檢查結(jié)果(Western blotting法)Tab.3 The measurements of the myocardium inflammatory factors(Western blotting)(±s，n=8)

*P＜0.05 vs groupⅣ;Group I:examination without transplantation or preservation;GroupⅡ:underwent transplantation without preservation;GroupⅢ:preserved with desiccation;Group Ⅳ:preserved with desiccation and CO;Group Ⅴ:preserved with HTK solution;TNF-α:Tumour necrosis factor-α;IL-1:interleukin-1;IL-17:interleukin-17;ICAM-1:intercellular adhesion molecule-1;GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

Item Group I GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣ GroupⅤTNF-α/GAPDH 0.70±0.05 0.60±0.06 1.21±0.05 0.92±0.05 1.09±0.07*0.75±0.07 0.78±0.06 IL-1/GAPDH 1.44±0.09 1.58±0.08 2.29±0.08 1.86±0.08 2.07±0.08*IL-17/GAPDH 0.26±0.04 0.24±0.02 0.76±0.06 0.37±0.05 0.42±0.03*ICAM-1/GAPDH 0.09±0.01 0.08±0.01 1.08±0.10

2.4 心肌組織切片蘇木精-伊紅染色(HE染色)檢查結(jié)果

CO高壓干燥保存組心肌纖維結(jié)構(gòu)較清晰，細(xì)胞核無明顯聚集、腫脹、破裂;而傳統(tǒng)的HTK低溫浸泡保存組心肌纖維結(jié)構(gòu)混亂不清，部分心肌纖維溶解，細(xì)胞核聚集、腫脹、破裂(圖3)。

圖3 高壓CO干燥組(Ⅳ組)及HTK浸泡組(Ⅴ組)心肌組織蘇木精-伊紅染色(HE染色)檢查Fig.3 The myocardial images(HE staining)of groupⅣ andⅤ;

3 討論

心臟移植是作為終末期心力衰竭唯一有效的治療方法，在過去的60年里，無論是在供心保存方法、手術(shù)技術(shù)還是圍術(shù)期治療等方面都取得了長足的發(fā)展，但仍有很多問題亟待解決。其中最主要的問題便是供心保存時間過短。

目前世界范圍內(nèi)普遍采用單純低溫浸泡保存法對老鼠、兔子、狒狒及人類心臟進(jìn)行保存(利用UW液這種臨床上常用的器官保存液作為保存液)，其保存最長時限為4～18 h［7］。然而自然界中的動植物通過減少自體組織內(nèi)水分而保持其生命力的現(xiàn)象普遍存在。例如某些細(xì)菌在進(jìn)入休眠期后可以減少自身60%水分甚至更多［8］。通過以上的觀察研究結(jié)果表明低溫干燥或許可以成為一種新型的、更為有效的離體心臟保存方式。

CO是一種可以干擾人體內(nèi)氧運(yùn)輸?shù)挠卸練怏w。但Tenhunen法［9］的研究表明正常人體內(nèi)也可以產(chǎn)生CO，其是一種體內(nèi)氧化血紅素代謝產(chǎn)物。而且近年來的研究［10-14］發(fā)現(xiàn)，CO不僅是體內(nèi)一種重要的細(xì)胞內(nèi)第二信使，其在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的病理生理過程中扮演著重要的調(diào)節(jié)角色。同時內(nèi)源性CO還表現(xiàn)出抗血管平滑肌細(xì)胞增生及抑制心臟排斥的生物學(xué)特性［15］。最重要的是，CO還具有抑制細(xì)胞內(nèi)新陳代謝及細(xì)胞凋亡的作用，并且在高壓的CO環(huán)境下上述作用更顯著［1，16］。

目前已知的干燥保存機(jī)制在于:使細(xì)胞內(nèi)總的含水量減少，尤其是游離水明顯減少，但仍保留一定量的結(jié)合水保護(hù)細(xì)胞內(nèi)一些高能化合物的活性，進(jìn)而維持細(xì)胞處于一種較低的代謝狀態(tài)［17］;而目前已知的高壓CO作用機(jī)制在于:1)CO能與細(xì)胞色素氧化酶中的2價(jià)鐵離子結(jié)合，抑制該酶的活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的氧化代謝和能量生成;2)在高壓CO與O2存在的環(huán)境中，兩者能建立起一種動態(tài)的平衡，代謝產(chǎn)物通過一種較低的能耗方式排出，而不會因代謝產(chǎn)物蓄積而引起壞疽;3)CO還具有抗凋亡作用［1］。

本實(shí)驗(yàn)是建立在日方實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上［1，18］，進(jìn)一步將低溫高壓CO干燥保存方法應(yīng)用于大動物(新西蘭兔)離體心臟的保存，并與傳統(tǒng)的低溫HTK浸泡保存方法進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)表明:1)“低溫高壓CO干燥保存組”的CK-MB、MB及LDH均較“低溫HTK浸泡保存組”低(P值均小于0.05)，表明低溫高壓CO干燥保存法對離體兔心的保存效果較傳統(tǒng)的低溫HTK浸泡保存方法優(yōu)越;2)IL-1、IL-17、TNF-α是常見的炎性反應(yīng)因子，它們不僅可以通過多種途徑激活體內(nèi)的炎性細(xì)胞、介導(dǎo)炎性反應(yīng)的進(jìn)程，還可以通過不斷促進(jìn)自身的合成從而增強(qiáng)炎性反應(yīng)［19-20］。其中TNF-α與IL-1本身還具有心肌抑制的作用［21］。“低溫高壓CO干燥保存組”心肌組織中的 IL-1、IL-17、TNF-α均較“低溫HTK浸泡保存組”低(P值均小于0.05)，表明低溫高壓CO干燥保存法可以通過抑制炎性反應(yīng)，減輕供心的缺血再灌注損傷，進(jìn)而起到保護(hù)供心的作用;3)通過分析HE染色圖片表明經(jīng)過高壓CO干燥保存法保存后心肌纖維結(jié)構(gòu)的完整性較傳統(tǒng)的HTK低溫浸泡保存法要好，進(jìn)而表明高壓CO干燥保存法對離體心臟的保存效果較傳統(tǒng)的HTK低溫浸泡保存法優(yōu)越。

本實(shí)驗(yàn)不僅驗(yàn)證了低溫高壓CO干燥保存方法對離體心臟的保存效果優(yōu)于傳統(tǒng)的低溫HTK浸泡方法，同時還證實(shí)了該保存方法在大動物離體心臟上同樣適用。而且本實(shí)驗(yàn)通過對供心組織中炎性反應(yīng)因子的測定，進(jìn)一步表明低溫CO干燥保存法可以通過抑制供心組織內(nèi)的炎性反應(yīng)，減輕缺血再灌注損傷，進(jìn)而起到保護(hù)供心的作用。

本研究應(yīng)用最新的氣體高壓干燥保存法對離體心臟進(jìn)行保存，并對其作用機(jī)制進(jìn)行探索，為解決供心保存時限短、保存效果不佳這兩個制約心臟移植發(fā)展的關(guān)鍵問題提供了一種新的可能性。但若想將該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果應(yīng)用于臨床實(shí)踐仍需要進(jìn)一步的研究。

［1］ Hatayama N，Naito M，Hirai S，et al.Preservation by desiccation of isolated rat hearts for 48 hours using carbon monoxide(PCO=4，000 hPa)and oxygen(PO(2)=3，000 hPa)［J］.Cell Transplant，2012，21(2-3):609-615.

［2］ 張鐘，肖澤周，郭義龍，等.一氧化碳高壓干燥環(huán)境對離體兔心的保護(hù)效果［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35(7):1008-1013.

［3］ 賀銘，曹西南.離體心臟保存技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2009，15(13):1992-1994.

［4］ 李剛，張倞，張楊，等.兔腹腔異位心臟移植模型的建立方法比較［J］.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2007，28(6):44-48.

［5］ 莊紅明，朱洪蔭，牛星燾，等.家兔同種心臟異位移植術(shù)［J］.中國病理生理雜志，1988，4(1):60-62.

［6］ Esper E，F(xiàn)iler S R，Wardrip C L，et al.Modified technique for abdominal heterotopic cardiac transplantation in the rabbit［J］.Lab Anim Sci，1998，48(2):201-205.

［7］ Makowka L，Zerbe T R，Chapman F，et al.Prolonged rat cardiac preservation with UW lactobionate solution［J］.Transplant Proc，1989，21(1 Pt 2):1350-1352.

［8］ Gaubin-Blanquet Y，Pianezzi B，Massue J P.Influence of various physical factors on the developmental capacities of the ovum of Artemia salina［J］.C R Seances Soc Biol Fil，1976，170(6):1305-1301.

［9］ Tenhunen R，Marver H S，Schmid R.The enzymatic conversion of heme to bilirubin by microsomal heme oxygenase［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1968，61(2):748-755.

［10］Chien J W，Sullivan K M.Carbon monoxide diffusion capacity:how low can you go for hematopoietic cell transplantation eligibility? ［Z］.2009，15(4):447-453.

［11］ Bojakowski K，Gaciong Z，Grochowiecki T，et al.Carbon monoxide may reduce ischemia reperfusion injury:a case report of complicated kidney transplantation from a carbon monoxide poisoned donor［J］.Transplant Proc，2007，39(9):2928-2929.

［12］ Hirano K，Sato Y，Kobayashi T，et al.Carbon monoxide hemoglobin and bilirubin metabolism in adult living-related liver transplantation［J］.Hepatogastroenterology，2003，50(54):1745-1748.

［13］ Jamieson R W，F(xiàn)riend P J.Organ reperfusion and preservation［J］.Front Biosci，2008，13:221-235.

［14］ Ozaki K S，Kimura S，Murase N.Use of carbon monoxide in minimizing ischemia/reperfusion injury in transplantation［J］.Transplant Rev(Orlando)，2012，26(2):125-139.

［15］ Clark J E，Naughton P，Shurey S，et al.Cardioprotective actions by a water-soluble carbon monoxide-releasing molecule［J］.Circ Res，2003，93(2):e2-e8.

［16］夏中元，王宇，劉菊英.厭氧培養(yǎng)箱法建立大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型［J］.臨床誤診誤治，2013，26(10):102-104.

［17］ Hatayama N，Yoshida Y，Seki K.A study on the perfusion preservation，resuscitation，and transplantation of a rat heart isolated for 96 hours［J］.Cell Transplant，2009，18(5):529-534.

［18］ Yoshida Y，Hatayama N，Seki K.Study on the preservation with CO(PCO=200-2，000 hPa)，resuscitation，and heterotopic transplantation of an isolated rat heart［J］.Cell Transplant，2009，18(5):535-540.

［19］ Chu W M.Tumor necrosis factor［J］.Cancer Lett，2013，328(2):222-225.

［20］ Shuh M，Bohorquez H，Loss G E Jr，et al.Tumor necrosis factor-alpha:life and death of hepatocytes during liver ischemia/reperfusion injury［J］.Ochsner J，2013，13(1):119-130.

［21］Kumar A，Thota V，Dee L，et al.Tumor necrosis factor alpha and interleukin 1beta are responsible for in vitro myocardial cell depression induced by human septic shock serum［J］.J Exp Med，1996，183(3):949-958.