俄羅斯庫(kù)頁(yè)島潮間帶沉積物可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性

劉 杰, 卜蒙蒙, 孫 景, 王延鵬, 李慧鵬, 張德超

(1. 青島科技大學(xué) 生物工程與技術(shù)系, 山東 青島 266042； 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 海洋生物分類與系統(tǒng)演化實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071)

庫(kù)頁(yè)島屬俄羅斯最大的島嶼, 面積 7.64萬(wàn) km2,大陸性氣候, 冬季氣候寒冷, 夏季涼爽多霧。該島地處北太平洋, 位于我國(guó)黑龍江出?？诘臇|部, 東、北面臨鄂霍次克海, 西隔韃靼海峽及涅韋爾斯科伊海峽并與俄羅斯哈巴羅夫斯克邊疆區(qū)相望, 南隔宗谷海峽與日本北海道宗谷岬相對(duì)。庫(kù)頁(yè)島上現(xiàn)有6 000多條河流和1 600余個(gè)湖泊, 其自然生態(tài)環(huán)境受人類活動(dòng)干擾較少,同時(shí)來(lái)自鄂霍次克海西岸的沉積物源, 其形成速率、厚度和有機(jī)碳含量等均為各類微生物生長(zhǎng)提供了良好而獨(dú)特的生存環(huán)境。一般來(lái)說(shuō), 特殊生態(tài)環(huán)境是獲取微生物新種質(zhì)資源的有效途徑, 也是進(jìn)行微生物新型生物活性物質(zhì)研發(fā)的基礎(chǔ)。而庫(kù)頁(yè)島區(qū)域(包括潮間帶)這類特殊生境的微生物多樣性狀況如何, 至今尚未見(jiàn)報(bào)道過(guò)。

本研究于2013年9月份從庫(kù)頁(yè)島潮間帶的4個(gè)采樣點(diǎn)采集了沉積物樣本若干份, 然后利用2216E、R2A、M1三種常規(guī)、寡營(yíng)養(yǎng)海洋細(xì)菌培養(yǎng)基, 對(duì)其可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離、純化和基于 16S rRNA 基因序列測(cè)定的系統(tǒng)發(fā)育分析, 目的在于了解庫(kù)頁(yè)島特殊生態(tài)區(qū)潮間帶沉積物可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性狀況,尋找和發(fā)現(xiàn)新的物種或分類單元。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

4份沉積物樣品分別于 2013年 9月 6日—11日采集于俄羅斯庫(kù)頁(yè)島潮間帶, 地理坐標(biāo)分別是：R-1 (47°08'30.1”N/142°03'30.1”E), R-2(46°56'39.3”N/143°05'46.7”E), R-3 (46°25'3.3”N/141°51'0.7”E) 和R-4(48°00'48.6”N/142°82'14.3”E)。去掉樣品表層約5 cm, 采集5～20 cm處沉積物樣品, 用滅菌的50 mL離心管 4℃暫時(shí)保存, 帶回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行菌株分離。所有采樣工具均事先經(jīng)過(guò)無(wú)菌消毒。

1.1.2 分離培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基(H)： 蛋白胨5 g, 酵母提取物1 g,瓊脂15 g。用1 000 mL 海水配制, pH 7.5。

R2A培養(yǎng)基(R)： 蛋白胨0.5 g, 酵母提取物0.5 g,葡萄糖0.5 g, 淀粉0.5 g, K2HPO40.3 g, MgSO40.05 g,丙酮酸鈉0.3 g , 瓊脂15 g。用1 000 mL 海水配制,pH 7.0。

M1培養(yǎng)基(M)： 蛋白胨2 g, 酵母提取物1 g, 可溶性淀粉10 g , 瓊脂15 g。用1 000 mL海水配制, pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 海洋細(xì)菌的分離

分別稱取沉積物樣品2 g, 加入到無(wú)菌的0.1%焦磷酸鈉溶液中, 在25 ℃、150 r/min條件下振蕩20 min。用生理鹽水(0.9%, NaCl)對(duì)樣品進(jìn)行10倍系列稀釋,涂布在三種不同的固體培養(yǎng)基上, 25℃培養(yǎng) 7 d, 根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等特征挑取不同單菌落, 每個(gè)菌落純化至少 2次。鏡檢合格后進(jìn)行革蘭氏染色和菌體形態(tài)觀察拍照, 用 25%甘油將純化菌株保存于-80℃超低溫冰箱。所有步驟均按無(wú)菌操作進(jìn)行。

1.2.2 海洋細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

分離純化菌株用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法[1]進(jìn)行細(xì)菌總DNA的提取。PCR采用細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增通用引物, 27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′), 1541r(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。PCR 反應(yīng)條件(30 個(gè)循環(huán))： 94 ℃預(yù)變性, 4 min； 94 ℃變性 1 min； 55 ℃復(fù)性 1 min； 72 ℃延伸 1 min, 共 30個(gè)循環(huán)； 最后 72 ℃延伸 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳, 獲得約 1.5 Kb的單一條帶,再經(jīng)切膠和試劑盒(天根生化科技有限公司產(chǎn)品)純化后, 送深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行雙向全長(zhǎng)序列測(cè)定。序列通過(guò)在 NCBI網(wǎng)站 GenBank進(jìn)行Blastn比對(duì), 找到相似性最高且是有效發(fā)表的典型菌株序列, 用 Clustal X 和 Mega 5.0軟件(采用Neighbor-joining方法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

本研究首先采用 27f單向引物對(duì)分離菌株進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序, 然后根據(jù)測(cè)序結(jié)果比對(duì)后進(jìn)行排重, 剩余菌株再進(jìn)行 27f、1541r雙向引物的全長(zhǎng)序列測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的測(cè)序結(jié)果與比對(duì)

本研究從采集樣品中共分離得到82株可培養(yǎng)細(xì)菌菌株。經(jīng)菌前期菌落、菌體形態(tài)觀察、革蘭氏染色、以及27f單引物初步測(cè)序后進(jìn)行排重, 最終合并選取其中45株代表性菌進(jìn)行雙向全長(zhǎng)16S rRNA基因(1.4～1.5 kb)測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)在NCBI的GenBank中比對(duì)后, 發(fā)現(xiàn)它們主要分布在4個(gè)門(mén)、6個(gè)綱、27個(gè)屬、44個(gè)種之中(表1)。其中變形桿菌門(mén)(Proteobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌群(19株), 占所選45株代表菌比對(duì)種類的42.2%； 放 線 菌 門(mén) (Actinobacteria)、 厚 壁 菌 門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)分別占總體的20.0%、20.0% 和 17.8%。從45株代表性菌的分離培養(yǎng)基來(lái)看, 有28株是2216E培養(yǎng)基分離得到的, 剩余17株菌是R2A、M1寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基分離得到的。

2.2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

將 45株代表菌的 16S rRNA基因序列提交GenBank進(jìn)行注冊(cè)(序列號(hào)為： KJ456596, KJ456597,KM362864-KM362906), 同時(shí)參考 Genbank和韓國(guó)EzTaxon 網(wǎng)站的比對(duì)結(jié)果及相關(guān)典型菌株序列, 利用軟件 Clustal X 和 Mega 5.0并采用 Neighborjoining方法, 分別構(gòu)建了變形桿菌門(mén)和擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。分別見(jiàn)圖1、圖2。從圖1和表1可以看出, 本研究分離的優(yōu)勢(shì)菌為變形桿菌門(mén)(19株, 占45株代表菌比對(duì)種類的42.2%), 分布于α- Proteobacteria和γ- Proteobacteria兩個(gè)綱。分布于α- Proteobacteria的菌株主要包括紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)和鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)。

其中屬于紅細(xì)菌目的有： 副球菌屬(Paracoccus)、簡(jiǎn)納西氏菌屬(Jannaschia)、熱帶單胞屬(Tropicimonas)、十八桿菌屬(Octadecabacter)、淺玫瑰色洛克氏菌屬(Loktanella)、居黃海屬(Seohaeicola)和亞硫酸鹽桿菌屬(Sulfitobacter)。從16S rDNA 序列相似性來(lái)看, 菌株R-1-M-3同分離自日本海Chazhma Bay沉積物的淺玫瑰色洛克氏菌(L.rosea)[2]的相似性為 99.7%；菌株 R-3-M-5-3同來(lái)自韓國(guó)東海海水的海亞硫酸鹽桿菌(Sulfitobacter marinus)[3]的相似性為 99.8%； 菌株R-3-H-5同來(lái)自日本海Troitza Bay海草的可疑亞硫酸鹽桿菌(S.dubius)[4]的相似性為99.6%； 而菌株R-1-H-3、R-4-M-3、R-1-R-9和R-2-R-1同它們系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近的模式菌株相似性均在97.3 %～98.1%之間, 以相似性大于98.5%作為同一個(gè)物種來(lái)估算[5-6](前提是 DNA-DNA雜交同源性≥70%, 且有獨(dú)特生理生化等表型性狀), 這 4株細(xì)菌有可能分別代表著副球菌屬、熱帶單胞屬、十八桿菌屬和居黃海屬內(nèi)的潛在新種。在鞘脂單胞菌目中只有 R-1-M-12、R-1-R-17和 R-1-M-4-1 這 3株菌, 均屬于色桿菌屬(Erythrobacter)。其中菌株R-1-M-12與分離自日本神奈川的Aburatsubo內(nèi)灣海藻的長(zhǎng)紅色桿菌(Erythrobacter longus)[7]的16S rRNA基因序列相似性為99.7 %； 菌株 R-1-M-4-1 與潮汐紅色桿菌的模式菌株E. gaetbuliSW-161T系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近[8], 16S rRNA基因序列相似性僅為97.7%, 依據(jù)上述定種原則, 該菌株也可能是色桿菌屬內(nèi)的一個(gè)潛在新種。

分布于 γ-Proteobacteria的菌株主要包括交替單胞菌目(Alteromonadales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)和假單胞菌目(Pseudomonadales)。其中菌株R-4-R-4與分離自俄羅斯西伯利亞凍土的鹽晶嗜冷桿菌Psychrobacter cryohalolentis的16S rRNA基因序列近乎相同(99.9%)[9]； 菌株R-3-M-11同分離自韓國(guó)南海海水的快生嗜冷桿菌Psychrobacter celer[10]的16S rRNA基因序列相似性為 99.2%； 菌株 R-2-H-2-1同分離自韓國(guó)濟(jì)州島黑沙灘的玄武巖希瓦氏菌Shewanella basaltis的16S rRNA基因序列相似性為99.1%； 而菌株 R-2-M-13 同解脂海桿狀菌(Marinobacter lipolyticus)模式菌株的16S rRNA基因序列相似性為 97.9%[11], 亦可初步判定可能為海桿狀菌屬內(nèi)的一個(gè)潛在新種。

表1 俄羅斯庫(kù)頁(yè)島潮間帶沉積物可培養(yǎng)細(xì)菌的分布Tab.1 Distribution of culturable bacteria isolated from intertidal sediments samples of Russian Sakhalin Island

圖1 變形細(xì)菌門(mén)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic relationships of culturable bacterial strains related to the Proteobacteria.

從圖 2和表 1看出, 有 9株菌分布于放線菌門(mén)(Actinobacteria)的放線菌綱(Actinobacteria C)。其中菌株 R-1-R-13-1與分離自韓國(guó)濟(jì)州島海水的海水微桿菌Microbacterium aquimaris的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近, 16S rRNA 基因序列近乎相同(99.9%)； 菌株R-3-M-4-1與分離自韓國(guó)東海阿穆?tīng)査箍藶澈Ｋ陌⒛聽(tīng)査箍藶雏}地桿菌Salinibacterium amurskyense的 16S rRNA基因序列也近乎相同(99.9%), 推測(cè)菌株 R-1-R-13-1和 R-3-M-4-1分別與M.aquimaris和S.amurskyense為同一物種或菌株。而菌株 R-4-M-5和 R-4-H-33與相似性最高的、分離自日本 Shinjiko湖泊近岸沉積物的湖泊微桿菌(M.lacus)和法國(guó)利摩日高鈾土壤的利摩日微桿菌(M. lemovicicum)[12]的 16S rRNA基因序列相似性分別為98.3%和98.1%, 推測(cè)有可能是微桿菌屬內(nèi)的2個(gè)潛在新種。剩余5株菌中, 除R-4-H-3與Demequina flavaHR08-7T的相似性為98.8%外, 其他菌株與最近標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性均大于98.3%。

圖2 擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic relationships of culturable bacterial strains related to Actinobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes.

厚壁菌門(mén)(Firmicutes)細(xì)菌在近海和淺海沉積物中較為常見(jiàn)[13]。本研究表明, 分布于厚壁菌門(mén)的 9株菌均屬于桿菌綱(Bacilli)。其中菌株 R-1-R-2A與分離自韓國(guó)黃海的 Daepo海灘灘涂的海微小桿菌Exiguobacterium marinum的16S rRNA基因序列幾乎相同(99.9%)； 菌株R-1-R-7-1和R-4-H-7同分離自韓國(guó)黃海灘涂的近海游動(dòng)球菌Planococcus maritimus系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近(相似性分別是 99.64%, 99.58%)；菌株R-1-R-11同分離自韓國(guó)東海Hwajinpo海灘海水的花津?yàn)┭挎邨U菌(Bacillus hwajinpoensis)的 16S rRNA基因序列相似性為99.6%[14]。

擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)細(xì)菌在海洋中分布也十分廣泛, 并且在很多水體和海洋沉積物中有較高的豐度, 很多擬桿菌能產(chǎn)生各種各樣的胞外水解酶,經(jīng)常與藻類形成共生關(guān)系, 還可以在大型海洋生物表面或內(nèi)部生長(zhǎng)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)共有 8個(gè)菌株屬于擬桿菌門(mén), 其中R-3-M-5-2屬于圓桿菌科(Cyclobacteriaceae)的食冷菌屬(Algoriphagus), 它同分離自日本海綠藻Acrosiphonia sonderi的維氏嗜冷菌Algoriphagus winogradskyi[16]的16S rRNA基因序列相似性為100%, 可能為同一菌株。其余7株菌均屬于黃桿菌科(Flavobacteriaceae), 其中菌株 R-1-M-5A同分離自日本海紅藻(Polysiphonia japonica)的多管藻海狀桿菌(Maribacter polysiphoniae)[17]的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近, 16S rRNA基因序列相似性為99.9%； 菌株 R-4-R-7同分離自日本海海水樣品的居水海菌(Maribacter aquivivus)的16S rRNA基因序列相似性為99.4%； 菌株R-3-M-8同分離自韓國(guó)褐藻的水域華美菌(Formosa undariae)的16S rRNA基因序列相似性為 99.2%； 菌株 R-1-R-2同分離自日本海 Troitsa灣海膽(Strongylocentrotus intermedius)的米氏海藻桿菌(Algibacter mikhailovii)的16S rRNA基因序列相似性為99.6%； 而菌株R-2-R-3-1同分離自韓國(guó)Gangjin灣海水的港津極地桿菌(Polaribacter gangjinensis)的16S rRNA基因序列的相似性只有94.2%, 依據(jù)現(xiàn)行國(guó)際細(xì)菌分類規(guī)則, 極有可能是不同于極地桿菌屬(Polaribacter)的一個(gè)潛在新屬。

3 討論

各種特殊生態(tài)環(huán)境是獲取微生物新種質(zhì)資源的有效途徑, 也是進(jìn)行微生物新型生物活性物質(zhì)研發(fā)的基礎(chǔ)。本研究采用常規(guī)2216E培養(yǎng)基以及R2A、M1兩種寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基, 首次對(duì)俄羅斯庫(kù)頁(yè)島潮間帶沉積物的可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了分離, 并做了基于 16S rRNA基因序列分析的系統(tǒng)發(fā)育多樣性研究。從培養(yǎng)分離效果來(lái)看, 常規(guī) 2216E培養(yǎng)基所分離菌株的多樣性要稍高于R2A和M1寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。從系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果來(lái)看, 所選擇的45株菌共分布于6個(gè)綱、27個(gè)屬、44個(gè)種。其中以變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群, 占45株代表菌株的 42.2%； 而分布于放線菌門(mén)(Actinobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)的細(xì)菌所占比例基本相當(dāng), 分別20.0%、20.0% 和 17.8%。這些菌株大部分與分離自日本和韓國(guó)近海的細(xì)菌在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上非常接近,推測(cè)它們有可能是通過(guò)海水環(huán)流等因素在太平洋北部海域之間進(jìn)行擴(kuò)散所致。另外我們還從分離菌株中發(fā)現(xiàn)有 8株菌(R-1-H-3、R-4-M-3、R-1-R-9、R-2-R-1、R-1-M-4-1、R-2-M-13、R-4-M-5、R-4-H-33)與相應(yīng)關(guān)系最近的標(biāo)準(zhǔn)模式菌株的 16S rRNA基因序列相似度在97.3%～98.3%, 1個(gè)菌株(R-2-R-3-1)的相似度為 94.2%。按照以往國(guó)際細(xì)菌分類通用規(guī)則,16S rRNA基因序列相似度＜97.0%和＜95.0%分別是確定新種群與新屬的必要前提之一[18]。然而由于16S rRNA基因序列的局限性, 在某些特殊情況下(如菌株具有比較明顯的生理、生化、生態(tài)特征,DNA-DNA雜交結(jié)果與16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果互不相符等情況), 這一規(guī)則被人們進(jìn)行不同程度地重新考量[5-6]。綜合近些年IJSEM上發(fā)表的新種、屬文獻(xiàn), 并根據(jù)Mincheol Kim等人[19]2014年對(duì)細(xì)菌種間 16SrDNA序列相似性的最新研究標(biāo)準(zhǔn)(即 16S rRNA 基因序列相似度＜98.5%的菌株均具有成為新種的可能)。我們認(rèn)為上述8株菌有成為潛在新種的可能, 而菌株R-2-R-3-1也已滿足成為新屬的必要條件之一, 當(dāng)然這尚需DNA-DNA雜交、G+C mol%、生理生化表性特征等多項(xiàng)分類數(shù)據(jù)進(jìn)行相互印證后方可確定。本研究表明俄羅斯庫(kù)頁(yè)島潮間帶沉積物中細(xì)菌具有非常高的物種多樣性, 該結(jié)果可為進(jìn)一步研究海洋細(xì)菌的區(qū)域性生物地理學(xué)提供有益參考。

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