吡啶硫酮類(lèi)防污劑對(duì)華美盤(pán)管蟲(chóng)早期不同發(fā)育階段的毒性效應(yīng)研究

商 群, 陳 新, 王超超, 葛天宇, 曹 瑞, 朱秀琴, 徐利婷, 唐 敏

(1. 海南大學(xué) 材料與化工學(xué)院, 海南 ?？?570228； 2. 海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 海南 ?？?570228； 3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 北京 100083)

近年來(lái), 隨著人們對(duì)海洋資源的開(kāi)發(fā)力度不斷加大, 海洋防污問(wèn)題也越來(lái)越嚴(yán)峻。目前化學(xué)防污法特別是防污涂料是最常用的防污技術(shù), 但防污涂料中使用的很多防污劑都具有不同程度的生態(tài)毒性。如有機(jī)錫曾是廣泛使用的高效廣譜防污劑, 但因有機(jī)錫對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境造成的嚴(yán)重破壞, 已在2008年被禁止用于海洋防污涂料[1]。吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅具有較好的防污效果, 且在海水中見(jiàn)光易分解,在國(guó)內(nèi)外作為防污助劑已被大量使用[2-3], 但研究發(fā)現(xiàn)在光照有限的地方則會(huì)明顯積累[4], 在越南和日本的船塢沉積物都已檢測(cè)到吡啶硫酮銅[5-6]。吡啶酮金屬的海洋生態(tài)毒性方面的研究很少, 以有機(jī)錫為前車(chē)之鑒, 因此, 有必要對(duì)吡啶酮金屬的生態(tài)毒性進(jìn)行較深入而系統(tǒng)的研究。

多毛類(lèi)華美盤(pán)管蟲(chóng)(Hydroides elegans)廣泛分布于熱帶和亞熱帶海域[7-9], 是中國(guó)南海近岸海域常見(jiàn)的多毛類(lèi)。其生活史分為營(yíng)浮游生活的幼蟲(chóng)期和固著生活的成體期。華美盤(pán)管蟲(chóng)具有生長(zhǎng)速度快、性成熟早、幼蟲(chóng)階段短和附著快速等特點(diǎn)[10-12]。在熱帶海域, 華美盤(pán)管蟲(chóng)全年都能進(jìn)行繁殖, 并且其在實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)及相應(yīng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法也已經(jīng)發(fā)展成熟, 因此是海洋生態(tài)毒理試驗(yàn)研究的理想生物。以往在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)華美盤(pán)管蟲(chóng)的研究主要集中在其早期發(fā)育[12-13]、海洋酸化對(duì)其影響[14-15]、基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)[7,16], 并作為一些防污劑及重金屬檢測(cè)的生態(tài)毒理研究生物[17-19]。作者采用中國(guó)南海常見(jiàn)物種 ——華美盤(pán)管蟲(chóng)為生態(tài)毒理研究對(duì)象, 通過(guò)研究吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅對(duì)其早期發(fā)育階段的急性毒性效應(yīng),以期為這兩種吡啶硫酮類(lèi)防污劑在中國(guó)南海的生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和安全使用劑量提供參考資料。1

1 材料和方法

1.1 材料

華美盤(pán)管蟲(chóng)成體采集于海南陵水近岸海域(18°30′N(xiāo), 110°01′20″E), 常年水溫為 24.5～25.5℃, 平均海水鹽度為33, pH為8.2。

1.2 方法

1.2.1 華美盤(pán)管蟲(chóng)成體的培養(yǎng)

將采集的華美盤(pán)管蟲(chóng)放在玻璃水族箱中短期培養(yǎng), 使用采集地海水。暫養(yǎng)期間連續(xù)充氣, 每日早晚各投餌 1次, 餌料為牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri), 半量換水, 每天1次。

1.2.2 配子的獲取和幼蟲(chóng)的培養(yǎng)

華美盤(pán)管蟲(chóng)的石灰質(zhì)管被破壞后, 產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng), 常在1 min之內(nèi)就會(huì)釋放大量配子[19]。用鑷子輕輕將華美盤(pán)管蟲(chóng)石灰質(zhì)棲管破壞, 取出成體, 用過(guò)濾海水(0.45 μm)潤(rùn)洗后, 于海水中靜置數(shù)分鐘, 即可獲得配子。

培養(yǎng)幼蟲(chóng)時(shí), 將獲取的卵子和精子按照適宜比例轉(zhuǎn)移到盛有海水的燒杯, 28 ℃條件下培養(yǎng)。每天換水 1次, 投餌 1次, 餌料為球等鞭金藻(Isochrysis galbana)。選取培養(yǎng)24 h的擔(dān)輪幼蟲(chóng)和72 h的后擔(dān)輪幼蟲(chóng)進(jìn)行毒理試驗(yàn)。

1.2.3 毒理試驗(yàn)

以二甲基亞砜(華大試劑)為溶劑, 將吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅(≥ 99%, 上海廣拓化學(xué))分別配制成 1000 mg/L的儲(chǔ)存液, 再根據(jù)需要稀釋成相應(yīng)的工作濃度。所有玻璃儀器及海水都經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌。試驗(yàn)期間保持溫度28 ℃, 無(wú)光照。每一處理組設(shè)平行樣3個(gè), 試驗(yàn)重復(fù)3次。本實(shí)驗(yàn)選取成熟的卵子和精子、培養(yǎng)24 h的擔(dān)輪幼蟲(chóng)和72 h的后擔(dān)輪幼蟲(chóng)進(jìn)行毒理試驗(yàn)。各處理組濃度根據(jù)預(yù)試驗(yàn)和等比原則設(shè)置相應(yīng)的毒物濃度范圍。

1.2.3.1 精子毒理試驗(yàn)

分別吸取 500 μL 精子溶液(40 000 個(gè)/μL), 暴露于不同濃度的待檢溶液(5 mL)中, 20 min后分別將處理過(guò)的精子溶液1000 μL與200個(gè)未處理的正常卵子混合受精, 60 min后加入20%福爾馬林終止受精, 之后靜置20 min, 然后在顯微鏡下觀察100個(gè)卵子, 計(jì)數(shù)其中卵子受精率。

1.2.3.2 卵子毒理試驗(yàn)

卵子毒理試驗(yàn)過(guò)程與精子毒理試驗(yàn)類(lèi)似。即分別將200個(gè)卵子暴露于不同濃度的測(cè)試液中, 20 min后向燒杯中加入100 μL未處理的精子溶液(40 000個(gè)/μL),混合受精。60 min后加入20%福爾馬林終止受精卵繼續(xù)發(fā)育, 靜置20 min后, 在顯微鏡下觀察100個(gè)卵子, 計(jì)數(shù)卵子受精率。

1.2.3.3 擔(dān)輪幼蟲(chóng)和后擔(dān)輪幼蟲(chóng)毒理試驗(yàn)

通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)獲得擔(dān)輪幼蟲(chóng)和后擔(dān)輪幼蟲(chóng)。分別吸取15只幼蟲(chóng), 向其中加入4 mL不同濃度的測(cè)試液, 分別在暴露24 h和48 h后, 計(jì)數(shù)各組的幼蟲(chóng)死亡數(shù)量和死亡率。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用 SPSS19.0, 通過(guò)概率單位回歸法分析得到半數(shù)抑制濃度(IC50)、半數(shù)致死濃度(LC50)及其 95%置信區(qū)間。配子受精發(fā)育的抑制率P=(Pe-Pc)/(1-Pc)×100%[21], 其中Pe為實(shí)驗(yàn)組未成功受精發(fā)育卵子比例,Pc為空白組未成功受精發(fā)育卵子比例。

2 結(jié)果

華美盤(pán)管蟲(chóng)成熟卵子直徑約為 41 μm。一般在28 ℃, pH 8.1,鹽度35的適宜條件下, 卵子受精后大概在30 min內(nèi)完成第一次分裂, 約50 min完成第二次分裂。受精之后100 min即可達(dá)到64細(xì)胞階段,大概2 h達(dá)到囊胚期, 12 h左右則能發(fā)育到擔(dān)輪幼蟲(chóng)階段。

2.1 吡啶硫酮對(duì)精子的毒性

以可發(fā)生卵裂的受精卵為成功受精的判斷依據(jù),其余未受精及受精但未分裂的卵子則都算作異常。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度處理組之間, 成功發(fā)育比例存在差異(圖1和圖2)。當(dāng)吡啶硫酮銅質(zhì)量濃度為5 μg/L時(shí), 即會(huì)對(duì)精子活性產(chǎn)生抑制作用, 此濃度對(duì)受精抑制率為6.25%； 質(zhì)量濃度為50 μg/L時(shí), 受精抑制率達(dá)到96.88%, 其IC50為19.49μg/L； 吡啶硫酮鋅質(zhì)量濃度為 10 μg/L時(shí), 抑制率為 12.63%, 質(zhì)量濃度為100 μg/L時(shí)抑制率為95.79%, 其IC50為36.74 μg/L(表 1)。

圖1 吡啶硫酮銅對(duì)華美盤(pán)管蟲(chóng)精子的毒性效應(yīng)Fig. 1 Toxic effect of copper pyrithione on sperm of Hydroides elegans

表1 吡啶硫酮類(lèi)防污劑對(duì)華美盤(pán)管蟲(chóng)不同時(shí)期的IC50、LC50及其95%置信區(qū)間Tab.1 IC50, LC50 values and the 95% confidence intervals of metal pyrithione on Hydroides elegans

圖2 吡啶硫酮鋅對(duì)華美盤(pán)管蟲(chóng)精子的毒性效應(yīng)Fig. 2 Toxic effect of zinc pyrithione on sperm of Hydroides elegans

2.2 吡啶硫酮對(duì)卵子的毒性

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為 25 μg/L的吡啶硫酮銅對(duì)卵子受精過(guò)程會(huì)產(chǎn)生抑制作用, 抑制率為2.06%, 當(dāng)質(zhì)量濃度為 200 μg/L時(shí), 抑制率達(dá)到 98.97%, 其IC50為 88.44 μg/L； 吡啶硫酮鋅質(zhì)量濃度 50 μg/L 時(shí),抑制率為5.32%, 當(dāng)質(zhì)量濃度為400 μg/L時(shí), 抑制率為 97.87%, 其 IC50為 159.59 μg/L(圖 3 和圖 4)。

圖3 吡啶硫酮銅對(duì)華美盤(pán)管蟲(chóng)卵子的毒性效應(yīng)Fig.3 Toxic effect of copper pyrithione on eggs of Hydroides elegans

圖4 吡啶硫酮鋅對(duì)華美盤(pán)管蟲(chóng)卵子的毒性效應(yīng)Fig. 4 Toxic effect of zinc pyrithione on eggs of Hydroides elegans

2.3 吡啶硫酮對(duì)擔(dān)輪幼蟲(chóng)的毒性

當(dāng)擔(dān)輪幼蟲(chóng)分別暴露于 1.0 μg/L的吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅時(shí), 幼蟲(chóng)死亡率與對(duì)照組無(wú)明顯差異。暴露于25 μg/L吡啶硫酮銅, 24 h和48 h擔(dān)輪幼蟲(chóng)的死亡率為100%, 24 h和48 h 的LC50分別為7.35 μg/L和5.00 μg/L； 當(dāng)吡啶硫酮鋅質(zhì)量濃度為50 μg/L時(shí),暴露時(shí)間在24 h和48 h的擔(dān)輪幼蟲(chóng)的死亡率都達(dá)到了100%, 24 h和48 h的 LC50分別為8.57 μg/L和6.67 μg/L (圖 5 和圖 6)。

2.4 吡啶硫酮對(duì)后擔(dān)輪幼蟲(chóng)的毒性

后擔(dān)輪幼蟲(chóng)分別暴露于 1.0 μg/L吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅時(shí), 幼蟲(chóng)死亡率與對(duì)照組無(wú)顯著差異。吡啶硫酮銅在 25 μg/L時(shí), 后擔(dān)輪幼蟲(chóng)在暴露時(shí)間為24 h和48 h時(shí)的死亡率均為100%,24 h 和 48 h 的 LC50分別為 8.57 μg/L 和 5.87 μg/L；吡啶硫酮鋅質(zhì)量濃度在50 μg/L時(shí), 后擔(dān)輪幼蟲(chóng)在24 h和48 h的死亡率都為100%, 24 h和48 h的 LC50分別為 12.03 μg/L 和 8.07 μg/L(圖 7 和圖 8)。

圖5 吡啶硫酮銅對(duì)華美盤(pán)管蟲(chóng)擔(dān)輪幼蟲(chóng)的毒性效應(yīng)Fig. 5 Toxic effect of copper pyrithione on trochophore of Hydroides elegans

圖6 吡啶硫酮鋅對(duì)華美盤(pán)管蟲(chóng)擔(dān)輪幼蟲(chóng)的毒性效應(yīng)Fig. 6 Toxic effect of zinc pyrithione on trochophore of Hydroides elegans

圖7 吡啶硫酮銅對(duì)華美盤(pán)管蟲(chóng)后擔(dān)輪幼蟲(chóng)的毒性效應(yīng)Fig. 7 Toxic effect of copper pyrithione on metatroch of Hydroides elegans

3 討論

圖8 吡啶硫酮鋅對(duì)華美盤(pán)管蟲(chóng)后擔(dān)輪幼蟲(chóng)的毒性效應(yīng)Fig. 8 Toxic effect of zinc pyrithione on metatroch of Hydroides elegans

多毛類(lèi)種類(lèi)繁多, 分布廣泛, 在很多海域的底棲生物群落中約占 30%～80%, 在海洋沉積與水體之間的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換過(guò)程中起著重要作用。此外, 一些多毛類(lèi)對(duì)海洋污染物較敏感, 易在實(shí)驗(yàn)室人工培育, 因此被選為生態(tài)毒理研究和毒性檢測(cè)的被檢生物[10,20,22]。華美盤(pán)管蟲(chóng)的早期生命階段能對(duì)重金屬如汞、鎘等表現(xiàn)出較高的敏感性[19], 其配子及幼蟲(chóng)在熱帶和亞熱帶地區(qū)全年都能夠獲得, 因此在中國(guó)南海海洋生態(tài)毒理研究方面, 華美盤(pán)管蟲(chóng)作為被檢生物具有一定優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 與吡啶硫酮鋅相比, 吡啶硫酮銅對(duì)華美盤(pán)管蟲(chóng)的早期生命階段普遍表現(xiàn)出更高的毒性。華美盤(pán)管蟲(chóng)精子對(duì)兩種吡啶硫酮類(lèi)防污劑的毒性的敏感性高于卵子。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng), 幼蟲(chóng)對(duì)兩種毒物的敏感性明顯提高。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明華美盤(pán)管蟲(chóng)擔(dān)輪幼蟲(chóng)階段對(duì)吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅毒性作用的敏感性顯著(P＞0.05)高于后擔(dān)輪幼蟲(chóng)階段?？赡茈S著華美盤(pán)管蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育逐漸成熟, 對(duì)吡啶硫酮類(lèi)防污劑的抗毒或解毒能力也相應(yīng)提高。

無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅毒性的敏感性差異較大, 紋藤壺腺介幼蟲(chóng) 24 h-LC50分別為 11和 29 μg/L, 鬼手?？?6 h-LC50則分別為2000和410 μg/L, 日本虎斑猛水蚤96h-LC50分別為30和170 μg/L[17], 相比較下, 華美盤(pán)管蟲(chóng)幼蟲(chóng)的敏感性更高。

吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅對(duì)華美盤(pán)管蟲(chóng)毒性要高于無(wú)機(jī)重金屬銅(無(wú)機(jī)銅對(duì)擔(dān)輪幼蟲(chóng) 48 h-LC50為100 μg/L, 而吡啶硫酮銅為 5.00 μg/L)和鋅(暴露于無(wú)機(jī)鋅的華美盤(pán)管蟲(chóng)精子和卵子的受精 IC50分別為945.31 μg/L和 2025.63 μg/L, 遠(yuǎn)高于吡啶硫酮鋅的36.74 μg/L 和 159.59 μg/L)[17,19]。

研究表明吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅會(huì)破壞細(xì)菌細(xì)胞生物膜和膜兩側(cè)的pH梯度, 也能與細(xì)胞內(nèi)的金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合, 從而破壞細(xì)胞中ATP的合成,并造成一些金屬離子的缺乏[23]。此外, 吡啶硫酮類(lèi)防污劑會(huì)影響無(wú)脊椎動(dòng)物的一些酶體系和相關(guān)蛋白表達(dá), 發(fā)現(xiàn)暴露于吡啶硫酮銅的多齒維沙蠶(Perinereis nuntia), 在質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí), 其十六烷酰輔酶A活性在 3 h內(nèi)急速下降, 之后維持較低水平不變；在質(zhì)量濃度為32 mg/L時(shí), 二磷酸尿核苷-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性在24 h內(nèi)先急速下降, 之后緩慢降低[24],當(dāng)吡啶硫酮鋅濃度為0.2 μmol/L時(shí)即會(huì)引起紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)鰓部和消化腺熱休克蛋白過(guò)度表達(dá), 造成基因損傷[25]。相比于這些生物指標(biāo),華美盤(pán)管蟲(chóng)配子和幼蟲(chóng)對(duì)吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅具有更高的敏感性, 而且檢測(cè)方法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性好, 在海洋生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)和環(huán)境監(jiān)測(cè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

可見(jiàn), 吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅對(duì)多種海洋生物具有較明顯的毒性作用, 對(duì)這兩種吡啶硫酮類(lèi)防污劑的使用量需更加慎重。同時(shí), 吡啶硫酮類(lèi)防污劑的作用機(jī)理以及在食物鏈中的傳遞過(guò)程都需進(jìn)一步的研究。

致謝：海南大學(xué)分析測(cè)試中心。

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